反應(yīng)體系對熒光定量PCR檢測乙肝核酸結(jié)果影響的分析

郭 楠，李寶萍，李慧萍，姚興偉，楊曦明

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院 檢驗科，北京 100700）

乙型肝炎是我國流行較廣的一種傳染性疾病?；颊哐逯蠬BV－DNA拷貝數(shù)最直接、可靠的反映HBV的復(fù)制情況，是乙型肝炎臨床診斷、判斷病情及預(yù)后，決定治療監(jiān)測的主要參考指標(biāo)。目前國際上公認(rèn)的具有參比價值的是羅氏公司生產(chǎn)的Roche COBAS Taqman 48 HBV DNA定量試劑（COBAS Taq Man HBV Test）［1－3］，但該試劑價格昂貴，且必須采用Roche公司專用的PCR儀。因此各大醫(yī)院多采用國產(chǎn)試劑進行檢測，為降低試劑成本，國產(chǎn)試劑普遍存在反應(yīng)體系較小的特點，雖簡化了核酸提取過程，但可能會對結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性造成影響。本實驗室自建立臨床基因擴增檢測技術(shù)以來，對實時熒光定量PCR用于臨床檢測時標(biāo)本處理和反應(yīng)體系的確立開展了研究，本文主要從以上兩方面探討其對檢測結(jié)果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

血清標(biāo)本來自于本院就診的乙肝患者，收集檢測 HBV－DNA結(jié)果范圍在10－103copies／ml和105－107copies／ml樣本各10例。

1.2 試劑與儀器

試劑盒來自上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司；實時熒光定量PCR儀為伯樂MJ Research Opticon II；質(zhì)控品由康徹斯坦生物公司提供。

1.3 方法

1.3.1 按患者HBV－DNA的拷貝數(shù)分組 低拷貝數(shù) 組 （10－103copies／ml）和 高 拷 貝 數(shù) 組 （105－107copies／ml），結(jié)果≥500 copies／ml為陽性。

1.3.2 按核酸提取時加樣量不同分組 A組：提取液A與待測樣本各50μl加入0.5 ml離心管中；B組：提取液A與待測樣本各100μl加入0.5 ml離心管中。震蕩混勻10秒，13 000轉(zhuǎn)離心10分鐘，棄去上清液，于沉淀中加入50μl提取液B震蕩10秒，放置恒溫金屬浴100℃加熱10分鐘，13 000轉(zhuǎn)離心2分鐘，保留上清液為核酸提取物。

1.3.3 按反應(yīng)體系量不同分組 Ⅰ組反應(yīng)體系為50μl，其中含有緩沖液30μl、Mg2＋5μl、熒光探針5 μl、Taq酶3μl，加入待測樣本核酸提取物7μl，混勻；Ⅱ組反應(yīng)體系為30μl，其中含有緩沖液18μl、Mg2＋3μl、熒光探針3μl、Taq酶2μl，加入待測樣本核酸提取物4μl，混勻。

1.3.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。不同組間數(shù)據(jù)比較用多因素方差分析；檢測結(jié)果與加樣量和反應(yīng)體系之間做偏相關(guān)分析。P＜0.01有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

高拷貝數(shù)組患者的HBV－DNA結(jié)果除ⅠB組與ⅡA組之間有明顯差異，P＜0.01，其余各組間沒有因提取體系和反應(yīng)體系的改變存在明顯差異，P＞0.05（見表1）。

低拷貝數(shù)組患者HBV－DNA結(jié)果除ⅡA組與ⅡB組之間沒有明顯差異，P＞0.05；其他各組因提取體系和反應(yīng)體系的改變存在明顯差異，P＜0.01（見表2）。

高拷貝數(shù)組的檢測結(jié)果與提取核酸時的加樣量及反應(yīng)體系的量之間呈低度相關(guān)，（r＝0.170，0.194，P＞0.05），差異沒有明顯統(tǒng)計學(xué)意義。

低拷貝數(shù)組的檢測結(jié)果與反應(yīng)體系的量之間呈中度相關(guān)（r＝0.744，P＜0.01），差異有明顯統(tǒng)計學(xué)意義；低拷貝數(shù)組的檢測結(jié)果與提取核酸時的加樣量低度相關(guān)（r＝0.256，P＞0.05），差異沒有明顯統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

在核酸定量技術(shù)的發(fā)展中，實時熒光定量PCR是發(fā)展最快和最有應(yīng)用價值的技術(shù)。在遺傳病、感染性疾病或腫瘤的基因診斷，用藥監(jiān)測等方面［4、5］，作用越來越大，被廣泛的應(yīng)用于臨床。特別是在乙型肝炎病毒檢測方面，具有明顯的優(yōu)勢，成為分子診斷的重要手段。而HBV－DNA檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性直接影響乙肝的診斷、治療方案的確定及療效的觀察。

本實驗研究通過改變提取核酸時加入的樣本量以及最終的反應(yīng)體系，發(fā)現(xiàn)高拷貝數(shù)組中在HBVDNA的濃度與加入的樣本量之間及反應(yīng)體系的量之間均呈低度正相關(guān)性，各組間的結(jié)果相差不到一個數(shù)量級。雖然ⅠB組與ⅡA組之間有明顯差異，P＜0.01，但是由于結(jié)果相差不到一個數(shù)量級（算術(shù)均數(shù)相差為2.3倍），而且臨床認(rèn)為一般量值變化在一個數(shù)量級內(nèi)均可視為沒有變化［6］，要求患者連續(xù)兩次結(jié)果之間大于2個數(shù)量級才認(rèn)為病毒部分應(yīng)答，用藥有效，因此對臨床診斷并無影響。對于低拷貝數(shù)組，10例ⅠA組小于1000copies／ml的樣本減少反應(yīng)體系后只有4例檢出有反應(yīng)，由于反應(yīng)體系的減小，原本低濃度的樣本中捕獲到病毒DNA的幾率大大降低，造成結(jié)果存在明顯差異，P＜0.01；即使增加提取核酸時加入的樣本量，仍然有3例檢出沒有反應(yīng)，其余7例＜500copies／ml，均為陰性，其中5例為假陰性，結(jié)果存在明顯差異，P＜0.01。并不能像在高拷貝數(shù)組中通過提取核酸時加大樣量來彌補造成的結(jié)果下降。

表1 高拷貝數(shù)組HBV－DNA定量結(jié)果

表2 低拷貝數(shù)組HBV－DNA定量結(jié)果

減小反應(yīng)體系，可以節(jié)約成本，對高拷貝數(shù)樣本影響小，但對于低拷貝數(shù)樣本影響很大，可能會造成結(jié)果的假陰性。所以在進行HBV－DNA檢測時，要確保反應(yīng)體系加入的核酸提取物足夠量，加大反應(yīng)體系可以保證核酸檢出的陽性率。

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