水楊酸結合拮抗酵母菌處理對冷藏草莓果實的抗性影響

秦曉杰，肖紅梅*，羅 凱，王曉霞，楊 蓉

(南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095)

水楊酸結合拮抗酵母菌處理對冷藏草莓果實的抗性影響

秦曉杰，肖紅梅*，羅 凱，王曉霞，楊 蓉

(南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095)

研究水楊酸與葡萄有孢漢遜酵母結合使用對草莓果實冷藏期間的抗性影響。將草莓果實分組，分別進行噴灑100μg/mL水楊酸(SA)與1×108CFU/mL拮抗酵母菌懸液、單獨1×108CFU/mL拮抗酵母菌懸液、無菌水為對照，置于(2±1)℃、相對濕度90%～95%冷藏條件下貯藏，定期測定相關酶指標。結果顯示：單獨拮抗酵母菌處理與結合SA處理均能降低引起果實膜脂過氧化產物丙二醛(MDA)含量的積累，提高過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、抗壞血酸氧化物酶(APX)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和β-1,3-葡聚糖酶等活性氧防御酶系的活性，延緩果實衰老。葡萄有孢漢遜酵母具有作為拮抗菌發展的潛力，且與SA結合處理的效果顯著優于單獨拮抗菌處理。

葡萄有孢漢遜酵母；水楊酸；草莓；酶活；抗性

草莓果實營養豐富，含水量高，深受消費者喜愛。但由于其果皮極薄、外皮無保護作用，極易受機械損傷和微生物侵染，從而導致腐爛變質[1]，而微生物侵染是最主要的因素。研究發現草莓果實腐爛變質的主要病害[2-4]有軟腐病(Rhizopus stolonifer)、灰霉病(Botrytis cinerea)、炭疽病(Colletotrichum acutatum)。目前國內外控制腐爛最有效的措施是低溫貯藏結合化學防腐劑，但長期使用化學藥劑導致病菌產生抗藥性，同時對人體健康和環境不利；而低溫處理需要較大的投資并且容易造成草莓貯藏中的冷害問題[5]。

近幾十年來，生物防治是目前采后病害控制研究的熱點之一，利用微生物防治取得了突破性進展，同時被認為是最有希望代替化學殺菌劑的方法之一[6-7]。酵母菌因具有生長繁殖能力強、遺傳穩定、廣譜抗菌性、可與化學殺菌劑相容，不產生對人體有害的代謝物質等優點[8]而成為拮抗微生物中最受關注的拮抗菌。目前，常用的有季也蒙畢赤酵母(Pichia guilliermondii)[9]、粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)[8,10]、羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii)[11]等。雖然拮抗菌可有效控制果實病害，但有研究表明，單獨使用拮抗菌對果蔬病害的控制難以達到化學殺菌劑的效果。

水楊酸(salicylic acid，SA)是一種簡單的酚類化合物，化學名稱為鄰羥基苯甲酸，參與并影響植物多種代謝過程。它能提高對非生物學逆境的抗性、誘導采后果實對病原菌的抗性及提高拮抗能力等相關抗性反應[12]。Xu Xiangbin等[13]研究顯示SA能夠顯著提高甜櫻桃的過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、幾丁質酶等防御酶的活性。Zhang Hongyin等[14-15]研究表明SA可以提高拮抗酵母菌(Rhodotorula glutinis)的拮抗能力，且發現兩者結合處理降低病害發生率，并且維持較好的品質。

選擇實驗室篩選出來的對果蔬采后病害具有較好效果的葡萄有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)為拮抗酵母菌，通過測定丙二醛(MDA)、過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、抗壞血酸氧化物酶(APX)、CAT、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)和β-1,3葡聚糖酶抗性相關酶的變化，探討SA與葡萄有孢漢遜酵母結合使用對草莓采后抗病性酶的誘導，并與拮抗酵母菌單獨使用的效果做比較，進一步為生物防治的應用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與培養基

1.1.1 果實

選擇‘豐香’草莓，清晨采摘于南京市馬群草莓生產基地，選擇轉色期(約八成熟)果實、大小一致、著色均勻、無病蟲害和機械傷的果實，分組待用。

1.1.2 菌株

拮抗酵母菌：由本實驗室篩選于草莓果實，經過純化鑒定為葡萄有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)菌株，保持在4℃的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar medium，PDA)斜面上。使用時用無菌接種環從斜面上取一環菌種劃線于PDA平板上，28℃條件下恒溫培養2d活化。

拮抗酵母菌懸液制備：用無菌接種環取一環活化后的菌種于裝有100mL馬鈴薯葡萄糖液體培養基(potato dextrose brothr medium，PDB)的250mL三角瓶中，28℃條件下180r/min振蕩培養24h，于4℃，5000×g冷凍離心10min，并用無菌水清洗2次以除去培養基。血球計數板計數后，用無菌水配制成濃度為1×108CFU/mL的菌懸液，備用。

1.1.3 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)：稱取新鮮去皮馬鈴薯200g切成小塊，加水煮沸30min，用四層紗布過濾，補充自來水，使濾液體積為1000mL，向濾液中加入20g葡萄糖和15～20g瓊脂，玻璃棒攪拌，充分溶解后分裝，于121℃濕熱滅菌30min后存放備用。

馬鈴薯葡萄糖培養基(PDB)：不加瓊脂的PDA培養基，于121℃濕熱滅菌30min后存放備用。

1.2 試劑與儀器

水楊酸(SA)為分析純試劑，使用前用0.45μm濾膜過濾滅菌處理后備用。

TGL20M臺式高速冷凍離心機 湘儀離心機儀器有限公司；紫外-可見分光光度計 北京萊伯泰科儀器有限公司；SW-CJ-ID型單人凈化工作臺 蘇州凈化有限公司；光學顯微鏡 日本尼康有限公司；HVE-50自動滅菌鍋 日本Hirayama有限公司；HZQ-F160全溫振蕩培養箱 太倉市實驗設備廠；恒溫恒濕培養箱 寧波海曙賽福實驗儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

冷藏條件下研究人工噴灑拮抗酵母菌與SA及單一噴灑拮抗酵母菌對草莓果實抗性的誘導。將新鮮草莓果實隨機分為3組，每組450個，備用。果實處理方法如下：對照(CK)組：用無菌水噴灑整個草莓果實；單一拮抗酵母菌處理組：用1×108CFU/mL拮抗酵母菌懸液噴灑；復合處理組(SA＋酵母菌)：先噴灑質量濃度為100μg/mL SA誘導2h后再噴灑1×108CFU/mL拮抗酵母菌。將3組果實常溫晾干，分別裝入塑料袋內，置于(2±1)℃，RH 90%～95%條件下貯藏。每隔4d測定POD、SOD、PAL、CAT、PPO、APX、β-1,3葡聚糖酶等相關酶的活性及MDA含量。

1.3.2 酶活性測定方法

1.3.2.1 丙二醛(MDA)含量

采用硫代巴比妥酸比色法[16]：取2g樣品用5mL 5%三氯乙酸(TCA)冰浴中研磨，于4℃、10000r/min冷凍離心15min，取2mL上清液加入2mL 0.67%硫代巴比妥酸(TBA)，煮沸5min，冷卻，分別測定A532nm、A600nm。

1.3.2.2 POD、SOD、CAT、APX酶活性測定

酶液制備：從4個草莓上稱取2g樣品，放入預冷的研缽中，加入5mL 0.05mol/L pH7.8磷酸鹽緩沖液(1%PVP)，冰浴中研磨，移至10mL離心管中，再加入3mL緩沖液沖洗并移至離心管中，置4℃、10000r/min離心15min，取上清液測定酶活性。每個處理取4個樣。

1) POD活性測定：采用愈創木酚法[17]，以反應液每分鐘在460nm波長處吸光度上升0.001為一個酶活力單位(U)；酶活性以U/(min·g)表示，以鮮質量計。

2) SOD活性測定：參照姜愛麗[18]的方法，NBT光還原法，以抑制反應50%為一個酶活力單位。

3) CAT活性測定：參照李仕飛等[19]的方法，以每分鐘240nm波長處吸光度下降0.001作為一個酶活力單位。

4)抗壞血酸氧化酶(APX)活性測定：參照朱廣廉等[20]的方法，掃描290nm波長處吸光度，以每分鐘氧化1μmol抗壞血酸(AsA)為一個酶活力單位，AsA氧化量按消化系數2.8mmol/L計算。

1.3.2.3 PPO、PAL、β-1,3葡聚糖酶活性測定

1) PPO活性測定：取2g草莓組織樣品，放入預冷的研缽中，加入5mL 0.2mol/L pH6.8檸檬酸-磷酸緩沖液，冰浴中研磨，移至10mL離心管中，再加3mL緩沖液沖洗并移至離心管內，在4℃、10000r/min離心15min，取上清液測酶活性。每處理取4個樣。采用鄰苯二酚比色法[21]測定，以每分鐘在398nm波長處吸光度變化0.001為一個酶活力單位，酶活性以U/(min·g)表示，以鮮質量計。

2) PAL活性測定：取2g樣品，放入預冷的研缽中，加入5mL 0.1mol/L pH8.8硼酸緩沖液，充分研磨后同上，離心取上清液測酶活性。每個處理4個樣。參照Assis等[22]的方法，分別以樣品反應管和對照反應管中溶液在290nm波長處吸光度變化0.001為1個酶活力單位，結果以U/(min·g)表示。

3) β-1,3葡聚糖酶活性測定：取2g樣品，加入8mL 0.05mol/L pH4.8檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液冰浴研磨，置于4℃、12000r/min離心20min，取上清液測定。參照余挺[23]的方法，以每毫升上清液每小時分解產生1mg葡萄糖為一個酶活力單位(U)，酶活性以U/g表示，以鮮質量計。

1.4 數據分析

采用SAS軟件，所有實驗數據用One-way ANOVA進行Duncan方差分析。

2 結果與分析

2.1 冷藏期間草莓果實MDA含量的變化

丙二醛(MDA)是膜脂過氧化作用的產物，其含量的多少反映機體內脂質過氧化的程度，是生物膜損傷程度的重要標志之一。衰老或在逆境條件下均會加劇果實的膜脂過氧化作用，進而促進膜的滲漏。圖1所示，處理組可以減緩草莓果實MDA含量的積累，延緩草莓果實的衰老。前期CK組與處理組的草莓果實MDA都呈明顯的上升趨勢，但是CK組的MDA含量上升較快，復合處理組MDA含量上升速度最慢，在貯藏第12天時，復合處理組的MDA含量顯著低于CK組(P＜0.05)，CK組MDA 含量比初始值增加32.6%，比同一時期的拮抗菌組、水楊酸復合處理組分別高32.0%、42.8%。同時，復合處理組的草莓果實MDA含量的變化要顯著低于單獨拮抗酵母菌組(P＜0.05)。相比之下，在貯藏后期MDA含量整體有所下降，但拮抗酵母菌單獨處理及復合處理的果實MDA含量仍明顯低于CK組。前期上升的原因可能為果實突然處于冷藏溫度逆境狀態下，導致果實機體發生膜脂過氧化作用。而后期隨著果實對外界環境的適應，MDA含量呈下降趨勢。經顯著性差異分析得出，水楊酸及拮抗酵母處理可以減緩MDA含量的積累，從而延長果實的衰老進程。

圖1 SA結合拮抗酵母菌處理對草莓MDA含量的影響Fig.1 Effect of SA combined with antagonistic yeast on the MDA content of strawberries

2.2 冷藏期間草莓果實POD、SOD、CAT、PPO活性的變化

從圖2A可知，草莓的POD活性在貯藏的過程中均呈先增加后降低的趨勢。水楊酸結合拮抗酵母菌可以誘導整個草莓果實的POD活性增加。在貯藏前20d，CK組與處理組的POD活性都呈逐漸上升的趨勢，在第20天時達到最大值，在貯藏的最后4d略有下降。原因是隨著貯藏時間延長，果實走向衰老，活性整體降低。整個貯藏過程中，CK組的POD活性都低于處理組的POD活性，單一拮抗酵母菌組低于復合處理組的POD活性，可能是由于活性氧產生和清除的動態平衡被打破，造成蛋白質等大分子物質的失活和降解，破壞了細胞功能結構，降低了酶的生物活性。貯藏24d經測定發現處理組的POD值與CK組之間存在顯著性差異(P＜0.05)，處理組的POD活性都高于CK組，尤其是復合處理組與CK組之間差異極顯著(P＜0.01)。

圖2 SA結合拮抗酵母菌處理對草莓POD(A)、SOD(B)、CAT(CC))、PPO(D)活性的影響Fig.2 Effect of SA combined with antagonistic yeast on the POD, SOD, CAT and PPO activities of strawberries

SOD是植物細胞中重要的活性氧清除酶之一。通過清除活性氧或某些自由基來減輕其對細胞的傷害，從而延緩果實的衰老。從圖2B可看出，隨著貯藏時間的延長，單一拮抗酵母處理組與CK組的SOD活性在貯藏期的第8天分別達到高峰，分別是61.52U/(h·g)和54.59U/(h·g)，而復合處理組在第8天第1次出現峰值(64.06U/h·g)后，在第16天又出現1次(60.64U/(h·g))峰值，隨后其SOD活性呈現下降趨勢。這兩個處理組的SOD活性都顯著高于對照組(P＜0.05)。復合處理組草莓的SOD變化幅度比其他組別小，同時SA誘導了果實SOD活性的提高，使其維持在較高水平。

CAT能分解H2O2，消除自由基的毒害作用，是植物體內清除H2O2的主要酶之一。由圖2C可見，草莓的CAT活性在貯藏期間呈先升后降趨勢。所有組別均在第8天達到高峰，在前8d呈緩慢升高，其中復合處理組活性上升較快，CK組則相對較慢。隨后，處理組CAT活性均下降，其中，CK組較為迅速，單一拮抗酵母處理、復合處理組則下降緩慢。CK組在貯藏前期，由于體內氧自由基迅速增多而誘使CAT活性增加，在后期隨著草莓呼吸強度及代謝的增加，氧自由基進一步增多，使其清除能力下降，CAT活性下降迅速。圖2C表明水楊酸復合處理組、單一拮抗酵母處理組能增強草莓果實的CAT活性，提高了活性氧清除率，保護草莓果實活性氧代謝平衡，抑制草莓果實由于呼吸及代謝導致的過氧化及衰老。復合處理組的CAT活性高于單一拮抗處理組。添加SA的拮抗酵母菌復合處理組CAT活性高于單一拮抗菌處理組，分析原因為：一定質量濃度的SA處理可以引起果實的應激反應，誘導果實的CAT抗性酶活性的增加，間接增強果實對病原菌的抗性。

PPO活性隨貯藏時間延長逐漸升高，不同處理組的PPO活性變化趨勢是相同的，均為先上升再下降的過程(圖2D)。處理組能誘導草莓果實PPO活性的提高，活性的高峰值出現在貯藏12d，且各峰值都顯著高于CK組(P＜0.05)。整個貯藏期間，處理組草莓果實的PPO活性一直高于CK組，復合處理組較為顯著(P＜0.05)，單一拮抗處理的效果不是太顯著(P＞0.05)。PPO是一種含銅的氧化酶，與組織的氧化呼吸和新陳代謝密切相關，在組織處于逆境環境時，PPO活性明顯升高，起到保護作用。這表明拮抗酵母結合水楊酸處理草莓能夠抑制草莓PPO活性的下降，從而提高果實的抗病能力，減少果實的腐爛。

2.3 冷藏期間APX、PAL、β-1,3葡聚糖酶活性的變化

圖3 SA結合拮抗酵母菌不同處理對草莓APX(A)、PAL(BB))、β--11,,33葡聚糖酶(C)活性的影響Fig.3 Effect of SA combined with antagonistic yeast on the APX, PAL and GLU activities of strawberries

從圖3A可知，SA、葡萄有孢漢遜酵母可以誘導果實APX活性的增加。CK組和處理組的草莓在貯藏過程中，APX活性呈現先上升再下降的趨勢，這可能是由于草莓果實貯藏前期及后期，果實內部代謝不同程度的變化，也不同程度的刺激了APX的活性。CK組果實在采后第12天達到最高峰，為98.77U/(min·g)，而后APX活性開始下降。其他處理果實的APX活性變化與對照相似，最大值也在采后的第12天出現，其中水楊酸的最大值126.51U/(min·g)，是CK組APX活性的1.3倍，顯著高于CK組(P＜0.05)，而單一的拮抗酵母處理并沒有顯著改變草莓果實采后APX活性(P＞0.05)。這也進一步說明水楊酸可以誘導果實APX活性的增加，增強拮抗菌的拮抗能力。

同APX變化相似，PAL活性呈現出一個先上升后下降的趨勢(圖3B)，貯藏期的前16d，處理組的PAL活性值一直上升，之后呈下降趨勢。這是草莓貯藏過程中自身生理的變化，葡萄有孢漢遜酵母及水楊酸可以引起果實的應激反應及其抗性誘導的機制。復合處理組能誘導草莓PAL活性的增加，且峰值明顯高于對照組和單一拮抗菌處理組(P＜0.05)，整個貯藏過程中，復合處理組的PAL活性始終高于其他兩組。因此，水楊酸復合處理組能顯著誘導PAL活性，延長草莓果實的貨架期。

β-1,3葡聚糖酶是植物抗真菌的重要抗性物質之一，可提高植物的抗病性。草莓的β-1,3葡聚糖酶活性變化趨勢如圖3C所示，在貯藏期的前8d，果實的β-1,3-葡聚糖酶活性均呈現上升，且分別在第8天達到最大值，水楊酸復合處理組的峰值為0.51U/g，顯著高于CK組和單一拮抗酵母處理組(P＜0.05)，是CK組峰值的2.4倍。在整個貯藏期內，CK組草莓果實的β-1,3-葡聚糖酶活性始終低于其他處理組，表明處理組能誘導草莓果實β-1,3-葡聚糖酶活性的增加，且拮抗酵母結合水楊酸處理的抑制效果更好。

3 結 論

水楊酸能有效降低果實的呼吸強度，延緩氧代謝進程，推遲果實的后熟衰老，其功能的研究已經成為生物學較為重要且發展迅速的研究領域之一[24]。張帆等[25]探討了采前水楊酸處理對樹莓果實貯藏效果及抗氧化能力的影響，證實水楊酸能夠清除羥自由基能力和總抗氧化能力，顯著提高果實采后的貯藏效果。實驗也進一步證實了SA能維持較高的SOD、APX、CAT、PPO活性，延遲草莓的衰老進程。

拮抗酵母菌結合化學試劑處理能顯著提高果實PAL、β-1,3-葡聚糖酶活性等主要防御酶的活性[26]，增強果實在貯藏期間對于病害的防御能力。實驗結果表明SA與拮抗酵母菌處理能誘導草莓PAL活性的增加，在整個貯藏期間，對照組草莓果實的β-1,3-葡聚糖酶活性始終低于其他處理組，表明拮抗菌單獨處理或者與水楊酸結合處理均能抑制草莓果實β-1,3-葡聚糖酶活性的增加，且與水楊酸結合處理的抑制效果更好。

實驗得出葡萄有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)單獨處理能夠引起果實的應激反應，提高草莓冷藏間果實的主要防御酶活性，延緩果實的衰老，因此進一步證實了該菌有拮抗作用，能夠作為一種有效的生物防治菌深入研究。水楊酸拮抗菌復合處理對草莓冷藏期間酶活性變化更顯著，維持在較高水平，提高了果實抗病性，延長草莓貯藏期。經水楊酸處理后，果實的相關抗性酶活性增加。顯著性差異分析得出：復合處理組的抗性酶活性顯著高于單一拮抗酵母處理組。

通過實驗可以看出，單獨的葡萄有孢漢遜酵母處理的效果遠遠沒有與SA結合處理的效果好。因此，采用適當濃度SA結合拮抗酵母處理可引起果實的應激反應，相關酶類表現出較高的活性，同時減緩MDA含量的積累，維持活性氧代謝的平衡，延緩果實衰老，提高果實的抗病性，減少果實腐爛發生。

但實驗只進行了對草莓果實采后的一些生理生化指標的研究，而對SA抑菌機理和其對拮抗酵母生物拮抗能力提高的作用機制上還欠缺進一步深入的研究，這可以作為今后的研究重點。

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Effect of Antagonistic Yeast in Combination with Salicylic Acid on Chilling Resistance of Strawberry Fruits during Cold Storage

QIN Xiao-jie，XIAO Hong-mei*，LUO Kai，WANG Xiao-xia，YANG Rong
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

The influence of Hanseniaspora uvarum in combination with salicylic acid on the chilling resistance of strawberry fruits under cold storage was studied. Strawberry fruits were divided into three groups which were sprayed with 1 × 108CFU/mL antagonistic yeast suspension alone or in combination with 100 μg/mL salicylic acid and sterile water as a control, respectively. The samples were stored at (2 ± 1) ℃ and 90%–95% RH. The activities of resistance-related enzymes were measured at regular intervals. The results showed that the yeast H. uvarum alone or in combination with SA decreased the content of MDA and induced the activities of peroxidase (POD), phenylalanine ammonia lyase (PAL), ascorbate peroxidase (APX), catalase (CAT), polyphenol oxidase (PPO), superoxide dismutase (SOD) and β-1,3-glucanase. The group treated with H. uvarum + SA had significant higher POD, PPO, SOD, CAT, APX, PAL, β-1,3-glucanase activities than the group treated with H. uvarum alone and CK. The combination of antagonistic yeast and SA may provide an effective strategy to reduce postharvest decay of strawberry fruits.

Hanseniaspora uvarum；salicylic acid；strawberry；enzyme activity；induced resistance

TS255.3

A

1002-6630(2013)18-0290-05

10.7506/spkx1002-6630-201318060

2012-09-05

江蘇省科技計劃項目(BE2010385)

秦曉杰(1990—)，女，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：2011108038@njau.edu.cn

*通信作者：肖紅梅(1970—)，女，副教授，博士，研究方向為農產品貯藏加工。E-mail：xhm@njau.edu.cn