低聲壓級次聲對大鼠腦缺血再灌注后膠質纖維酸性蛋白表達的影響①

李德潔，范建中，吳紅瑛，何任紅，陳琦，劉夏

低聲壓級次聲對大鼠腦缺血再灌注后膠質纖維酸性蛋白表達的影響①

李德潔，范建中，吳紅瑛，何任紅，陳琦，劉夏

目的 探討低聲壓級次聲對大鼠腦缺血再灌注后周圍膠質纖維酸性蛋白(GFAP)表達的影響。方法線栓法制作大腦中動脈腦缺血(MCAO)2 h再灌注模型。將36只雄性Sprague-Dawley大鼠隨機分成假手術組(n=12)、次聲組(n=12)和模型組(n=12)，每組再分為3 d、7 d兩個亞組，每組6只。次聲組在缺血再灌注12 h后連續予次聲干預2 h/d，模型組干預過程中除不開機外，其余過程同次聲組，假手術組不做任何干預。在治療3 d、7 d后(處死前)對大鼠進行神經功能缺損評分(mNSS)，腦組織切片采用免疫組織化學方法觀察腦缺血周圍GFAP表達變化。結果次聲7 d組大鼠mNSS評分較模型組降低(P＜0.05)；次聲組腦缺血周圍GFAP表達的積分光密度(IOD)均較模型組顯著增高(P＜0.001)。結論低聲壓級次聲能增強大鼠腦缺血再灌注后GFAP的表達。

次聲；缺血/再灌注；膠質纖維酸性蛋白

[本文著錄格式]李德潔，范建中，吳紅瑛，等.低聲壓級次聲對大鼠腦缺血再灌注后膠質纖維酸性蛋白表達的影響[J].中國康復理論與實踐,2013,19(2):124-128.

腦卒中具有高發病率、高致殘率的特點。中國每年新發腦卒中患者約200萬人，其中70%～80%的腦卒中患者因為殘疾不能獨立生活[1]。循證醫學證實，腦卒中康復是降低致殘率最有效的方法，也是腦卒中組織化管理模式中不可或缺的關鍵環節[2]。物理因子治療作為康復治療的一種手段，正日益得到康復醫師的重視，目前使用的康復物理因子主要包括聲、光、電、磁等。而次聲作為物理因子的一種，是頻率在0.0001～20 Hz之間的聲波，由物體機械振動產生。有報道稱，低聲壓級次聲可通過輕柔的共振作用，改善局部循環，增加細胞活力，從而對生物體產生有利作用[3]。本實驗將通過研究低聲壓級次聲對缺血再灌注大鼠腦保護作用機制，為將來腦缺血神經康復治療提供相關理論基礎和新的治療手段。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物分組 健康Sprague-Dawley雄性大鼠36只，體重230～270 g，南方醫科大學實驗動物中心提供，室溫、安靜環境、常濕飼養，普通飼料，自由飲水。質量合格證號：SCXK(粵)-2011-0015。將大鼠36只隨機分為假手術組、模型組和次聲組，每組各12只。

1.1.2 試劑和儀器 次聲治療儀Infrasound 8TM(美國CHI公司)；光學顯微鏡(日本Olympus)；數碼相機(日本Olympus)；GFAP一抗(Abcam，兔抗大鼠)，二抗(山羊抗兔，EnVision，DAKO)；Olympus DP controller拍照系統(日本Olympus)；Image-Pro Plus 6.0圖像處理系統(USAMedia Cybernetics)。

1.2 方法

1.2.1 造模 參照Longa[4]報道的線栓法并加以改進，線栓采用直徑為0.24～0.26 mm、長度為4.0 cm的尼龍魚線。以10%水合氯醛(0.45 ml/100 g)腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，無菌消毒，分離并暴露右側頸總動脈及頸內外動脈，線栓由頸外動脈插入頸內動脈，插入大腦中動脈時稍遇阻力，即可停止，進線長度約18 mm，2 h后拔出線栓實現缺血再灌注，縫合手術切口，手術過程中維持肛溫37℃左右，安靜環境下飼養。假手術組不插入尼龍線，余過程同前。

在規定缺血時限內(術后2～3 h)按Longa[4]5分制評分標準評分：0分，無神經損傷癥狀；1分，不能伸展對側前爪；2分，向外側劃圈；3分，向對側傾倒；4分，不能自發行走，意識喪失。1分以上視為造模成功。

對造模成功大鼠進行隨機分組，每組分3 d、7 d兩個亞組，每個亞組6只，如未出肢體癱瘓(0分)或已死亡的動物被剔除，采用差額補充的方法以保證每個亞組各6只大鼠。次聲組的各亞組分別在缺血再灌注12 h后連續給予次聲干預2 h/d，模型組干預過程中除不開機外，其余過程同次聲組。

1.2.2 次聲信號參數和處理方法 次聲治療儀Infrasound 8TM由次聲聲頭和主機兩部分組成，主機面板上輸出檔位分為3種次聲頻率和強度組合檔，本實驗用3檔進行處理。經第四軍醫大學等單位研制的“便攜式野外低頻信號實時測試智能分析系統”對實驗中的次聲信號測試，結果顯示該儀器在3檔時輸出次聲頻譜主要集中4～20 Hz，次聲主頻信號的頻譜是隨機變化的，聲強79.75～86.11 dB。

1.2.3 療效評價 各組大鼠神經行為學評分于處死前參照改良神經功能缺損評分(modified Neurological Severity Score,mNSS)[5]進行，最后經心臟灌注取腦切片進行HE染色及免疫組織化學顯色，觀察各組大鼠行為學評分及腦缺血周圍膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表達的變化。

1.2.4 標本制作 各組動物到達預定時間后，用10%水合氯醛(0.45 ml/100 g)麻醉，用經處理后頭端較鈍的16號針針頭穿刺入左心室至主動脈起始部，眼科剪剪開右心耳，先用200 ml生理鹽水快速沖洗體內血液，續用4%多聚甲醛250 ml進行灌注固定，斷頭取腦，在視交叉前后1～3 mm之間取腦片，用同一固定液后固定6～8 h。常規脫水、透明、石蠟包埋，冠狀切片，片厚5 μm，備用。

1.2.5 HE染色 石蠟切片常規用二甲苯脫蠟，經各級乙醇至水洗，入蘇木素染色5 min，自來水沖洗，70%的鹽酸乙醇分色30 s，水洗后酸化伊紅復染2 min，水洗，脫水、透明、中性樹膠封片。

1.2.6 GFAP免疫組化 切片進行常規透明，梯度酒精脫蠟，采用高壓熱修復，將切片置于檸檬酸緩沖液(pH=6.0)高壓鍋煮沸3～5 min，3%過氧化氫封閉后加入GFAP(1∶800)一抗，4℃孵育過夜，復溫后加入二抗，孵育30 min，加入DAB顯色(具體操作見DAKO說明書)，常規脫水透明封片。陰性對照用PBS緩沖液代替一抗，其余步驟相同。

1.2.7 圖像采集與分析 一個標本取一張切片，在同等亮度、像素、曝光、對比度等條件下采用光學顯微鏡及Olympus DP controller拍照系統用10×40放大倍數，在腦缺血周圍隨機取6個視野，對GFAP指標進行統一圖像拍照，保證每個亞組有36個視野，最后用Image-Pro Plus 6.0圖像處理系統計算出每一個視野的積分光密度值(integrated optical density,IOD)。

1.3 統計學分析

采用SPSS 13.0統計學軟件進行分析。數據符合正態分布，各組數據以(±s)表示，數據符合正態分布，各組之間比較采用獨立樣本t檢驗，顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 mNSS

假手術組術后基本正常，各時間點mNSS總分均為0分。次聲組、模型組與假手術組比較均有神經功能損傷。次聲3 d組與模型3 d組評分無顯著性差異(P＞0.05)；模型7 d組得分低于模型3 d組(P＜0.05)；次聲7 d組得分明顯低于次聲3 d組(P＜0.01)；次聲7 d組得分低于模型7 d組(P＜0.05)。見表1。

表1 模型組和次聲組mNSS評分

2.2 HE染色

假手術組形態結構清楚，神經元細胞數目多，細胞排列規整，核深染，核膜清晰，核仁明顯。模型3 d組腦缺血周圍可見組織結構紊亂、疏松，膠質細胞稍增生，數量增多，神經元細胞正常形態消失、部分神經元細胞核固縮，胞體縮小變形，殘留的神經元細胞周圍間隙增寬。次聲3 d組缺血區組織結構紊亂，膠質細胞增生，神經元細胞正常形態消失，可見殘留萎縮的紅色神經元細胞。泡沫細胞增多，可見噬神經現象。模型7 d組缺血中心區域組織結構紊亂，神經元細胞核固縮，腦缺血周圍膠質細胞增生，數量較模型3 d組增加，炎性浸潤。次聲7 d組缺血區周圍膠質細胞增生更加明顯，可見泡沫細胞和噬神經現象。見圖1。

2.3 GFAP免疫組化

在20×10光學顯微鏡下觀察，假手術組側腦室室管膜下區有少量GFAP表達，而模型組、次聲組側腦室室管膜下區的GFAP表達增多，以次聲組最為明顯(以7 d組為例)。見圖2。

在40×10光學顯微鏡鏡下觀察結果，假手術3、7 d組偶見少量陽性表達，顏色較淺，突起纖細，IOD值較小，不納入統計比較。次聲各組與模型各組GFAP陽性表達明顯增多，著色深染，突起增多，尤其次聲各組陽性表達更為明顯。見圖3。

2.4 IOD

在40×10光學顯微鏡下觀察，模型7 d組IOD明顯高于模型3 d組(P＜0.01)；次聲各組IOD均顯著高于相應模型各組(P＜0.001)；次聲7 d組IOD明顯高于次聲3 d組(P＜0.01)。見表2。

圖2 各7 d組GFAP免疫組化染色(光學顯微鏡，200×)

圖3 各組GFAP免疫組化染色(光學顯微鏡，400×)

表2 在40×10光學顯微鏡下各組GFAP表達的IOD

3 討論

腦缺血后病灶中心區神經元死亡引起的神經功能缺損至今無確切有效的藥物治療方法，但是能否在早期康復介入以減少繼發性功能障礙已成為成為康復醫學的一個熱點話題。目前許多研究顯示，卒中后早期進行的經顱磁刺激和神經肌肉電刺激等康復治療能更有效促進腦卒中患者偏癱肢體功能的恢復[6-7]，但是有關次聲對腦缺血后神經修復研究鮮見報道。

我們曾應用次聲治療儀Infrasound 8TM產生的低聲壓級次聲作用于腦缺血再灌注大鼠，結果證實低聲壓級次聲在每天作用120 min，連續7 d，可明顯改善神經癥狀，縮小梗死面積，并通過刺激胰島素樣生長因子-1分泌從而起到腦保護作用[8]。袁華等利用8 Hz、90 dB和130 dB次聲作用于大鼠，每天2 h，分別作用1、7、14、21、28 d后發現次聲使大鼠海馬中GFAP陽性膠質細胞的數量增加，得出8 Hz、90 dB和130 dB次聲可以激活大量星形膠質細胞，對神經元具有保護作用的結論。研究僅局限于正常大鼠，未對腦缺血大鼠進行研究探討[9]。張國鋒等對腦缺血再灌注損傷大鼠應用16 Hz、130 dB次聲預處理可明顯減輕大鼠腦梗死的容積，改善神經功能學評分[10]，未對星形膠質細胞是否參與腦保護做進一步研究。唐晨等在低聲壓級次聲對大鼠海馬多唾液酸神經細胞黏附分子(PSA-NCAM)表達的影響研究中發現，16 Hz、90 dB次聲作用可引起大鼠海馬(PSA-NCAM)表達增強，提示低強度次聲在導致中樞神經損傷同時，還能促使機體啟動修復機制，增強神經干細胞遷移能力，從而參與次聲性腦損傷的修復[11]。

在上述研究基礎之上，我們希望通過研究次聲處理后腦缺血周圍GFAP表達變化及神經行為學變化進一步證明次聲能夠通過影響腦缺血后星形膠質細胞而起到腦保護作用。因為GFAP是腦內成熟星形膠質細胞主要的中間纖維蛋白，是細胞骨架蛋白，GFAP在星形細胞中有豐富而特異性的表達，是星形細胞活化的客觀標志蛋白。星形膠質細胞是中樞神經系統中最多的細胞類型，約占正常成年人腦細胞總數的40%。既往研究觀點認為，星形膠質細胞可以形成膠質瘢痕，阻止軸突再生穿越[12]，但是近10年隨著對星形膠質細胞研究日益增多，越來越多的研究發現在中樞神經損傷后星形膠質細胞可以分泌多種神經營養因子，如血管內皮生長因子、腦源性神經營養因子、神經生長因子、堿性成纖維細胞生長因子等，保護受損神經元，增加突觸聯系，促進神經修復及神經功能恢復[13-16]。

本研究中HE染色發現，腦缺血后腦缺血周圍膠質細胞增多，膠質細胞包括星形膠質細胞、少突膠質細胞及小膠質細胞。我們通過免疫組織化學方法觀察腦缺血周圍GFAP表達變化來反映星形膠質細胞變化。根據實驗結果我們發現，20×10光學顯微鏡下腦缺血7 d的模型組及次聲組患側腦室室管膜下區GFAP表達明顯增多，尤其次聲組更為顯著。在40×10光學顯微鏡下發現，次聲組腦缺血周圍GFAP的IOD較模型組顯著增加(P＜0.001)。但是次聲3 d組與模型3 d組mNSS評分無顯著性差異(P＞0.05)；次聲7 d組較模型7 d組評分下降(P＜0.05)；模型7 d評分低于模型3 d組(P＜0.05)；次聲7 d組評分低于次聲3 d組(P＜0.05)。次聲干預3 d能夠促進GFAP的表達，但是行為功能癥狀改善情況與對照組相比不夠明顯，而次聲干預3 d相比次聲干預7 d能夠顯著增加GFAP的表達，并改善缺血后大鼠的神經行為功能癥狀。

根據實驗結果初步推斷，次聲干預7 d后大鼠腦缺血周圍星形膠質細胞表達增多以及神經癥狀的明顯改善可能是由于人體及動物組織器官的固有振蕩頻率通常在20 Hz以下，處于次聲場內的人及動物的組織器官與次聲產生共振效應[3]。在共振效應作用下，腦缺血周圍的星形膠質細胞除了由靜止的星形膠質細胞活化而來[17]以外，還可能和次聲激活大量側腦室室管膜下區星形膠質細胞增殖有關。增殖的側腦室室管膜下區星形膠質細胞在次聲和腦產生共振效應引導下向腦缺血周圍遷移，分泌多種神經營養因子參與神經修復，從而促進腦缺血后大鼠神經癥狀恢復。

由于本次實驗主要集中研究低聲壓級次聲對腦缺血再灌注損傷后急性期星形膠質細胞表達情況的影響，未能對于后期星形膠質細胞及軸突情況進行研究。結合本次實驗結果初步推斷，腦缺血再灌注次聲治療后膠質細胞的大量增生，可能因為早期暫未形成膠質瘢痕阻礙軸突再生、穿越，而主要起到促進神經生長因子分泌、神經重塑、增加突觸聯系，進而改善神經功能作用。具體機制有待后續實驗進一步證實。

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Effect of Infrasound on Expression of Glial Fibrillary Acidic Protein after Cerebral Ischemia/Reperfusion in Rats

LI De-jie,FAN Jian-zhong,WU Hong-ying,et al.Department of Rehabilitation,Nanfang Hospital of Southern Medical University,Guangzhou 510515, Guangdong,China

ObjectiveTo explore the effect of infrasound on the expression of glial fibrillary acidic protein(GFAP)after cerebral ischemia/reperfusion in rats.MethodsThe model of cerebral ischemia/reperfusion in rats was induced with intraluminal middle cerebral artery occlusion(MCAO)with nylon monofilament suture.36 male adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group(n=12), model group(n=12)and infrasound group(n=12),then each group was randomly divided into 3 d and 7 d subgroups,with 6 rats in each subgroup.The infrasound group was treated with infrasound for 2 h every day 12 h after operation,the model group was treated in the same way turning off the power,the sham group received no treatment.They were evaluated with the modified Neurological Severity Score (mNSS)3 and 7 d after treatment(before being executed),and brain tissue slices were immunohistochemically stained to observe the expression of GFAP around the ischemic sites.ResultsCompared to the model group,the mNSS score in 7 d infrasound group decreased significantly(P＜0.05),the integral optical density(IOD)of GFAP around the focus was significantly higher in the infrasound group than in the model group(P＜0.001).ConclusionInfrasound can increase the expression of GFAP after cerebral ischemia/reperfusion in rats.

infrasound;ischemia/reperfusion;glial fibrillary acidic protein

R743

A

1006-9771(2013)02-0124-05

2012-08-13

2012-09-17)

南方醫科大學南方醫院院長基金(No.2010Z005)。

南方醫科大學南方醫院康復醫學科，廣東廣州市510515。作者簡介：李德潔(1984-)，男，江蘇徐州市人，碩士研究生，主要研究方向：神經系統疾病康復。通訊作者：范建中。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.02.007