生物活性材料支架誘導成年大鼠神經(jīng)再生修復腦損傷的研究①

陳蘭，孫敏，張皚峰，楊朝陽，李曉光

·基礎研究·

生物活性材料支架誘導成年大鼠神經(jīng)再生修復腦損傷的研究①

陳蘭1，孫敏1，張皚峰2，楊朝陽1，李曉光1

目的 應用生物活性材料支架誘導神經(jīng)再生修復成年大鼠創(chuàng)傷性腦損傷。方法52只成年雄性Wistar大鼠分為假手術組、單純損傷組、單純殼聚糖組和生物活性材料支架組，分別于術后3 d、7 d、2周、4周、2個月和3個月通過組織化學、免疫組織化學和神經(jīng)示蹤方法檢測神經(jīng)再生和損傷區(qū)新生神經(jīng)元的來源。結(jié)果應用生物活性材料支架后，海馬齒狀回(DG)和室管膜下區(qū)(SVZ)中BrdU+/Nestin+和BrdU+/Dcx+細胞較單純殼聚糖組和單純損傷組明顯增加。損傷區(qū)內(nèi)BrdU+/Nestin+、BrdU+/Dcx+及BrdU+/ MAP2+神經(jīng)細胞較單純殼聚糖組和單純損傷組明顯增加。DiI標記SVZ細胞后，損傷區(qū)中見DiI+/NeuN+神經(jīng)元。結(jié)論生物活性材料支架激活DG和SVZ的神經(jīng)干細胞，SVZ中的神經(jīng)干細胞遷移到損傷區(qū)，并分化為成熟神經(jīng)元。

腦損傷；生物活性材料支架；神經(jīng)干細胞；神經(jīng)再生；遷移；分化；大鼠

[本文著錄格式]陳蘭，孫敏，張皚峰，等.生物活性材料支架誘導成年大鼠神經(jīng)再生修復腦損傷的研究[J].中國康復理論與實踐,2013,19(4):318-323.

中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)損傷后再生修復的研究已有百余年歷史。1890年Thompson等初次用成年貓和成年狗的大腦皮質(zhì)移植來修復創(chuàng)傷性腦損傷[1]。神經(jīng)組織學家卡哈曾斷言哺乳動物CNS不能再生。這個觀念長期占主導地位，因此人們普遍認為CNS損傷后再生能力極其有限。

直到1958年，Liu和Chambers首次證實成年哺乳動物CNS損傷后仍具有可塑性[2]，人們重新將目光聚焦在CNS損傷后的再生修復問題上來。此后，不斷有人證明成年哺乳動物腦內(nèi)室管膜下區(qū)(subventricular zone,SVZ)尾側(cè)[3]、紋狀體[3]、皮層[4]、視神經(jīng)、橫隔、胼胝體、脊髓、視網(wǎng)膜和下丘腦[3-8]部存在多潛能前體細胞。體外研究顯示，這些細胞都能自我更新并分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞。神經(jīng)發(fā)生就是指神經(jīng)元發(fā)育的整個過程，即從一個前體細胞分裂開始，一直到新的神經(jīng)元成熟、整合并具有功能的過程[9]。神經(jīng)前體細胞能自我更新，但多處于靜止狀態(tài)。當CNS受損或變性時，細胞微環(huán)境發(fā)生改變，神經(jīng)干細胞(neural stem cells,NSCs)被激活，發(fā)生增殖、遷移、分化、整合，促進神經(jīng)元再生及損傷部位腦組織結(jié)構(gòu)和功能的恢復[10]。成年哺乳動物腦內(nèi)存在神經(jīng)前體細胞以及持續(xù)的神經(jīng)發(fā)生，為腦損傷后的修復提供了可能。本實驗旨在探討應用生物活性材料支架修復腦損傷后，腦內(nèi)NSCs的增殖情況，以及是否能夠遷移到損傷的海馬CA1區(qū)，產(chǎn)生新的神經(jīng)元。

1 材料和方法

1.1 材料

52只成年雌性Wistar大鼠，體重200～220 g。SPF級，首都醫(yī)科大學實驗動物部提供。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 6%水合氯醛按6 ml/kg體重腹腔麻醉，腹面向下固定于大鼠立體定位儀上；頭部采取正中矢狀切口，切開皮膚及皮下組織，鈍性分離，暴露顱骨。根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜確定損傷中心位點為前囟后(-)3.8 mm，正中線左旁開(L)2 mm，硬腦膜下(V)3 mm，門齒棒低于耳間線(-)3.3 mm；在手術顯微鏡下，用牙科鉆以上述位點為損傷中心，鉆開一2×2 mm范圍的骨窗，掀去骨瓣，注意不要損傷硬腦膜[11]；在手術顯微鏡下打開硬腦膜，采用自制的“生物組織吸除裝置”[12]機械性損傷并吸除體積約為2×2× 3 mm的腦組織，其中包括海馬CA1區(qū)及覆蓋其上的大腦皮質(zhì)，立即植入與損傷等體積的生物活性材料支架；縫合皮膚切口，碘酒消毒傷口。

實驗分組：①假手術組：僅打開骨窗；②單純損傷組：通過手術打開顱骨骨窗，且損傷大腦皮層海馬CA1區(qū)后，不施加任何干預措施；③單純殼聚糖組：損傷區(qū)填充單純殼聚糖，即不結(jié)合神經(jīng)營養(yǎng)因子-3 (neurotrophin-3,NT-3)的殼聚糖載體；④生物活性材料支架組：損傷區(qū)填充生物活性材料支架，即殼聚糖與NT-3的復合物[11]。

1.2.2 側(cè)腦室注射 術后3 d側(cè)腦室注射神經(jīng)示蹤劑1, 19-二(十八烷基)-6,69-二(4-磺苯基)-3,3,39,39-四甲基吲哚碳氰(DiI)(碧云天公司)。側(cè)腦室注射位點為前囟后(-)1.5 mm，正中線左旁開(L)1.3 mm，硬腦膜下(V) 3.5 mm。每只動物以1 μl/min的速度，注射20 μl。

1.2.3.5-溴尿嘧啶(BrdU)注射 術后連續(xù)5 d腹腔注射10 mg/ml BrdU(SIGMA公司)0.5 ml/100 g體重，每12小時注射1次。

1.2.4 取材及固定 分別于術后3 d、7 d、2周、4周、2個月和3個月每組各取2只大鼠，4%多聚甲醛溶液經(jīng)心臟灌注固定，取腦后，固定于4%多聚甲醛溶液中，過夜后取出，30%PB蔗糖溶液脫水，大腦冠狀面連續(xù)冰凍切片，切片厚度14 μm。

1.2.5 組織化學染色 大腦切片進行尼氏染色，觀察損傷區(qū)內(nèi)的新生神經(jīng)元。

1.2.6 免疫組織化學染色

工作人員公路橋梁養(yǎng)護工作理念的轉(zhuǎn)變是公路橋梁養(yǎng)護工作得以順利開展的基礎和前提。對此公路橋梁養(yǎng)護的工作人員必須要緊隨時代的變遷不斷改革創(chuàng)新橋梁養(yǎng)護工作的理念與模式，提高公路橋梁養(yǎng)護預防工作的重視程度；其次，公路橋梁養(yǎng)護的工作人員還要充分利用互聯(lián)網(wǎng)信息技術，對公路橋梁的養(yǎng)護工作進行全面監(jiān)督與管理，不斷提高其養(yǎng)護工作的專業(yè)化水平；最后，相關工作人員還需要吸收和借鑒國外公路橋梁養(yǎng)護的工作理念與工作模式，以此為基礎構(gòu)建公路橋梁養(yǎng)護的預防控制機制，將公路橋梁養(yǎng)護中可能出現(xiàn)的問題進行預防與規(guī)避，進而不斷提高公路橋梁養(yǎng)護工作的準確性與科學性[7]。

1.2.6.1 NeuN免疫熒光化學染色 小鼠抗NeuN(SIGMA公司)，滴度1∶150。一抗4℃孵育60 h后，加入Texas-red標記的山羊抗鼠IgG熒光二抗(Jakson公司)，滴度1∶100，室溫避光10 h。最后加入Hoechst33342(SIGMA公司)，滴度1∶2000，室溫孵育5 min。50%甘油PB封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6.2 BrdU和Nestin雙重免疫熒光化學染色 小鼠抗BrdU(北京中杉金橋生物技術有限公司)，滴度1∶100，兔抗Nestin(SIGMA公司)，滴度1∶800。一抗4℃孵育60 h后，分別加入Texas-red標記的山羊抗鼠IgG熒光二抗和Cy2標記的山羊抗兔IgG熒光二抗(Jakson公司)，滴度1∶100，室溫避光10 h。最后加入Hoechst33342，滴度1∶2000，室溫孵育5 min。50%甘油PB封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6.3 BrdU和Dcx雙重免疫熒光化學染色 小鼠抗BrdU，滴度1∶100，兔抗Dcx(SIGMA公司)，滴度1∶120。一抗4℃孵育60 h后，分別加入Texas-red標記的山羊抗鼠IgG熒光二抗和Cy2標記的山羊抗兔IgG熒光二抗，滴度1∶100，室溫避光10 h。最后加入Hoechst33342，滴度1∶2000，室溫孵育5 min。50%甘油PB封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6.4 BrdU和MAP2雙重免疫熒光化學染色 小鼠抗BrdU，滴度1∶100，兔抗MAP2(SIGMA公司)，滴度1:800，一抗4℃孵育60 h后，分別加入Texas-red標記的山羊抗鼠IgG熒光二抗和Cy2標記的山羊抗兔IgG熒光二抗，滴度1∶100，室溫避光10 h，最后加入Hoechst33342，滴度1∶2000，室溫孵育5 min，50%甘油PB封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6.5 NeuN免疫熒光化學染色 側(cè)腦室注射DiI后，加兔抗NeuN(SIGMA公司)，滴度1∶150。一抗4℃孵育60 h后，加入Cy2標記的山羊抗兔IgG熒光二抗，滴度1∶100，室溫避光10 h。最后加入Hoechst33342，滴度1∶2000，室溫孵育5 min。50%甘油PB封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學分析

每只動物取4張切片，高倍顯微鏡下觀察并計數(shù)DG、SVZ、損傷區(qū)各4個視野的陽性細胞數(shù)。采用SPSS 16.0軟件，組間比較行重復測量的單因素方差分析。

2 結(jié)果

本課題組以前的研究觀察到生物活性材料支架組損傷區(qū)內(nèi)有神經(jīng)元樣的核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear transcription factor,NF)陽性細胞[11]。為了進一步驗證這些NF+細胞是否是神經(jīng)元，我們進行尼氏染色和NeuN免疫組織化學染色。術后4周，在生物活性材料支架組損傷區(qū)觀察到大量尼氏染色陽性細胞(圖1)，這些尼氏染色陽性細胞和正常的神經(jīng)元相比體積較小(圖2)，而單純損傷組損傷區(qū)內(nèi)無尼氏染色陽性細胞(圖3)。并且，生物活性材料支架組損傷區(qū)中這些細胞表達神經(jīng)元標記物NeuN(標記成熟神經(jīng)元)(圖4)。

2.2 神經(jīng)再生

術后3 d，生物活性材料支架組在海馬齒狀回(gyrus dentatus,DG)(圖5)和SVZ(圖6)中觀察到BrdU+/ Nestin+的NSCs，數(shù)量多于單純殼聚糖組(P＜0.05)，并且單純殼聚糖組的數(shù)量多于單純損傷組(P＜0.05)(圖7)。同時，生物活性材料支架組損傷區(qū)內(nèi)也觀察到了BrdU+/Nestin+的NSCs(圖8和圖9)。而單純殼聚糖組和單純損傷組損傷區(qū)內(nèi)少見BrdU+/Nestin+細胞。

術后2周，生物活性材料支架組的DG(圖10)和SVZ中均觀察到BrdU+/Dcx+的遷移中的未成熟神經(jīng)元，數(shù)量多于單純殼聚糖組和單純損傷組(P＜0.05)(圖 11)。同時，生物活性材料支架組損傷區(qū)中觀察到BrdU+/Dcx+細胞(圖12和圖13)，而單純殼聚糖組和單純損傷組損傷區(qū)內(nèi)少見BrdU+/Dcx+細胞。

術后4周，生物活性材料支架組損傷區(qū)觀察到大量BrdU+/MAP2+神經(jīng)元(圖14和圖15)，數(shù)量多于單純殼聚糖組(P＜0.05)和單純損傷組(P＜0.05)(圖16)。

2.3 損傷區(qū)新生神經(jīng)元的來源

以往有研究表明，海馬附近腦室周圍存在大量內(nèi)源性神經(jīng)前體細胞，參與修復海馬損傷[13]。為了驗證本實驗采用的損傷模型中損傷區(qū)新生神經(jīng)元是否來源于腦室周圍(即SVZ)，我們向側(cè)腦室注射熒光染料DiI，標記腦室周圍細胞。術后4 d，假手術組中DiI仍停留在側(cè)腦室周圍，標記側(cè)腦室周圍細胞，并未擴散(圖17)。術后4周，生物活性材料支架組損傷區(qū)可見大量DiI標記的細胞(圖18)。這些DiI+細胞部分表達成熟神經(jīng)元標記物NeuN(圖19和圖20)。

圖1 術后4周，生物活性材料支架組損傷區(qū)中見尼氏染色陽性細胞，虛線內(nèi)為損傷區(qū)(10×,Bar:200 μm)

圖2 術后4周，生物活性材料支架組損傷區(qū)內(nèi)尼氏染色陽性細胞，細胞體積較小(40×,Bar:50 μm)

圖3 術后4周，單純損傷組損傷區(qū)內(nèi)無尼氏染色陽性細胞，虛線內(nèi)為損傷區(qū)(10×,Bar:200 μm)

圖4 術后4周，生物活性材料支架組損傷區(qū)熒光顯微鏡觀察(免疫熒光染色，10×，Bar:200 μm)

圖5 術后3 d，生物活性材料支架組DG熒光顯微鏡觀察(免疫熒光染色，20×，Bar:100 μm)

圖6 術后3 d，生物活性材料支架組SVZ熒光顯微鏡觀察(免疫熒光染色，10×，Bar:200 μm)

圖7 術后3 d，各組DG和SVZ中BrdU+/Nestin+細胞的百分比

圖8 術后3 d，生物活性材料支架組損傷區(qū)激光共聚焦觀察(免疫熒光染色，20×，Bar:100 μm)

圖9 術后3 d，生物活性材料支架組損傷區(qū)激光共聚焦觀察(免疫熒光染色，63×)

圖10 術后2周，生物活性材料支架組DG熒光顯微鏡觀察(免疫熒光染色，20×，Bar:100 μm)

圖11 術后2周，各組DG和SVZ中BrdU+/Dcx+細胞的百分比

圖12 術后2周，生物活性材料支架組損傷區(qū)激光共聚焦觀察(免疫熒光染色，20×，Bar:100 μm)

圖13 術后2周，生物活性材料支架組損傷區(qū)激光共聚焦觀察(免疫熒光染色，63×)

圖14 術后4周，生物活性材料支架組損傷區(qū)激光共聚焦觀察(免疫熒光染色，20×，Bar:100 μm)

圖15 術后4周，生物活性材料支架組損傷區(qū)激光共聚焦觀察(免疫熒光染色，63×)

圖16 術后4周，各組損傷區(qū)中BrdU+/ MAP2+細胞的百分比

圖17 術后4 d，假手術組熒光顯微鏡觀察。DiI+細胞停留在側(cè)腦室周圍，未向外擴散(免疫熒光染色，10×，Bar:200 μm)

圖18 術后4周，生物活性材料支架組熒光顯微鏡觀察。損傷區(qū)內(nèi)出現(xiàn)大量DiI+細胞(免疫熒光染色，40×，Bar:50 μm)

圖19 術后4周，生物活性材料支架組損傷區(qū)激光共聚焦觀察(免疫熒光染色，20×，Bar:100 μm)

圖20 術后4周，生物活性材料支架組損傷區(qū)激光共聚焦觀察(免疫熒光染色，63×)

3 討論

創(chuàng)傷性腦損傷后，損傷區(qū)內(nèi)的神經(jīng)細胞大量死亡或缺失，神經(jīng)纖維斷裂、崩解，最終導致相應的功能障礙或缺失。卡哈認為，神經(jīng)元一旦死亡不能再生。這使得人們一度普遍認為神經(jīng)元丟失是永久性的，不能恢復。這也使得修復CNS損傷成為難以解決的世界難題。隨著科研技術的進步，不斷有研究表明成年體內(nèi)存在持續(xù)的神經(jīng)發(fā)生，也就是CNS能夠產(chǎn)生新的神經(jīng)元[14-15]。創(chuàng)傷性腦損傷后，損傷邊緣產(chǎn)生膠質(zhì)瘢痕，阻礙神經(jīng)纖維長入損傷區(qū)。前期研究表明，損傷區(qū)填充NT-3和殼聚糖，能夠明顯減少膠質(zhì)瘢痕的形成，并在損傷區(qū)觀察到神經(jīng)元樣細胞，進一步使認知功能得到改善[11]。本實驗在前期研究的基礎上，進一步驗證生物活性材料支架是通過激活腦內(nèi)原有NSCs，增殖并遷移到損傷區(qū)，分化為成熟神經(jīng)元，并進一步研究了遷移細胞的來源。

3.1 NSCs的原位增殖與分化

研究表明，創(chuàng)傷性腦損傷后3 d，DG中Nestin+細胞開始增多；損傷后7 d，DG中Dcx+細胞開始增多[16]。Fallon等[17]證明，腦損傷后SVZ細胞原位增殖，第9天遷移到損傷區(qū)，遷移的細胞為BrdU+。近年來，研究神經(jīng)損傷后的NSCs增殖多用到BrdU[18-20]。

本實驗使用BrdU來標記應用生物活性材料支架后增殖的細胞。Nestin標記NSCs[11]，Dcx標記遷移中的未成熟神經(jīng)元[21]。成年動物大腦的主要神經(jīng)發(fā)生區(qū)域在SVZ和DG[14]中。本實驗結(jié)果顯示，術后3 d，生物活性材料支架組損傷區(qū)中觀察到BrdU+/Nestin+細胞，而單純殼聚糖組損傷區(qū)內(nèi)見少量BrdU+/Nestin+細胞，單純損傷組損傷區(qū)中未見BrdU+/Nestin+細胞。結(jié)果表明，生物活性材料支架能夠激活SVZ和DG中的NSCs，使其增殖，并部分遷移到損傷區(qū)內(nèi)，進一步分化。

術后2周，生物活性材料支架組SVZ和DG以及損傷區(qū)中觀察到BrdU+/Dcx+細胞，多于單純殼聚糖組和單純損傷組。

MAP2是成熟神經(jīng)元的標記物。術后4周，生物活性材料支架組損傷區(qū)出現(xiàn)大量BrdU+/MAP2+神經(jīng)元，數(shù)量多于單純殼聚糖組，而單純損傷組損傷區(qū)中未見BrdU+/MAP2+神經(jīng)元。

以上結(jié)果表明，生物活性材料支架及單純殼聚糖均能激活腦內(nèi)原有的NSCs，而以生物活性材料支架的效果更佳。損傷大鼠大腦SVZ和DG中的NSCs原位激活，并遷移到損傷區(qū)，分化為MAP2+神經(jīng)元。

3.2 NSCs的遷移

DiI能夠沿細胞膜擴散而標記整個細胞膜，體內(nèi)能夠穩(wěn)定標記1年[22]。本實驗將DiI注射到側(cè)腦室標記腦室周圍的細胞。本實驗結(jié)果顯示，假手術組注射DiI后，DiI+細胞停留在腦室周圍，并未擴散，說明正常大鼠腦室周圍細胞很少向海馬遷移。術后4周，生物活性材料支架組損傷區(qū)中出現(xiàn)大量DiI+細胞，說明這些細胞主要來源于SVZ。這些DiI+細胞部分表達NeuN。這一結(jié)果表明，應用生物活性材料支架后，損傷區(qū)內(nèi)新生神經(jīng)元部分來源于SVZ。SVZ的細胞遷移到損傷區(qū)后，并未全部分化為神經(jīng)元，或分化成的神經(jīng)元并未發(fā)育成熟，因此DiI+細胞并未全部表達NeuN。

3.3 展望

如何通過促進中樞神經(jīng)再生來提高損傷修復的臨床治療效果，是神經(jīng)科學研究者迫切需要回答的問題。因此，神經(jīng)細胞損傷修復研究具有十分重要的理論及現(xiàn)實意義。外源性細胞的倫理道德因素及其他種種原因，限制了其應用。很多研究已證明，缺血、創(chuàng)傷和神經(jīng)變性后，成年哺乳動物體內(nèi)的神經(jīng)前體細胞會原位增殖。因此應用神經(jīng)營養(yǎng)因子及生物活性材料增加神經(jīng)再生，是避免外源性NSCs移植缺陷、更好地修復腦損傷的一種方法，也是腦損傷修復的發(fā)展方向，已經(jīng)成為當前研究的熱點。

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Repair of Injured Adult Rat Brain by Inducing Neural Regeneration with Bioactive Material Scaffolds

CHEN Lan,SUN Min, ZHANG Ai-feng,et al.Department of Neurobiology,Capital Medical University,Beijing 100069,China

ObjectiveTo repair the brain of adult rats with traumatic brain injury by inducing neural regeneration with biological scaffolds.Methods52 adult male Wistar rats were divided into control group,lesion group,blank chitosan carriers group and bioactive material scaffolds group.The neural regeneration and the origin of the newborn neurons in the injury area were detected through histochemistry,immumochemistry and neural tracing on the 3rd day,7th day,2nd week,4th week,2nd month and 3rd month after operation.ResultsAfter application of bioactive material scaffolds,the BrdU+/Nestin+and BrdU+/Dcx+cells in gyrus dentatus(DG)of hippocampus and subventricular zone(SVZ)were significantly more than those of the other groups.The BrdU+/Nestin+,BrdU+/Dcx+and BrdU+/MAP2+neural cells in injury area of the bioactive material scaffolds group were significantly more than those of the other groups.After application of DiI to label the SVZ cells,DiI+/NeuN+neurons were observed in the injury areas.ConclusionBioactive material scaffolds can activate the neural stem cells in SVZ and DG.The neural stem cells in SVZ can migrate to the injury area and then differentiate into mature neurons.

brain injury;bioactive material scaffolds;neural stem cells;neural regeneration;migrate;differentiation;rats

R745

A

1006-9771(2013)04-0318-06

2013-01-31

2013-03-05)

1.北京市科委重點項目(No.D09080104660000)；2.國家自然基金重點項目(No.31130022)；3.國家科技支撐計劃(No.2012BAI17B04)；4.國家“863”計劃(No.2012AA020506)。

1.首都醫(yī)科大學神經(jīng)生物學系，北京市100069；2.北京友誼醫(yī)院口腔科，北京市100050。作者簡介：陳蘭(1987-)，女，漢族，河北獻縣人，碩士研究生，主要研究方向：應用組織工程學方法修復腦損傷的研究。通訊作者：李曉光(1959-)，男，漢族，吉林長春市人，博士，教授，主要研究方向：應用組織工程學方法修復神經(jīng)系統(tǒng)損傷的研究。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.04.002