轉化生長因子β1/Smads通路在急性心肌梗死后心肌重塑中的作用及祛瘀生新法的干預研究①

張秀靜，趙海濱，王帥，郭夢，許曉英，馬迪

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)后的心肌重塑與心臟破裂、室壁瘤形成及心力衰竭等嚴重并發癥密切相關，在AMI死亡及預后中起至關重要的作用[1]。AMI后心肌重塑機制復雜，后果嚴重，療效不理想，相關研究亟待深入。張海嘯等實驗表明，轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β,TGF-β1)/Smads信號通路的過度激活在誘發并加重AMI后心肌重塑病理過程中居關鍵地位[2]。但目前對其活化調控缺乏有效手段。祛瘀生新法以中醫“祛瘀血、生新血”為理論基礎，對AMI后心肌重塑療效肯定。本課題組通過研究祛瘀生新法在大鼠AMI后心肌重塑中的干預作用及對TGF-β1/Smads通路和骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)動員的影響，探討祛瘀生新法對AMI后心肌重塑的效應機制，為祛瘀生新藥治療AMI后心肌重塑提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

成年清潔級雄性Wistar大鼠50只，體重(250±10)g，合格證編號：0240574，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。

血塞通軟膠囊：生產批號為Z20040016，由昆明圣火制藥有限責任公司提供；總RNA試劑提取盒：由康為世紀提供；5×SYBR Green PCR Master Mix：AB Applied Biosystems公司；dNTP：Solarbio公司；OligodT、Rnasin、M-MLV：PROMEGA公司；引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，PE標記的骨髓基質干細胞抗原1抗體及干細胞生長因子受體(c-kit)均由北京博奧森生物科技有限公司提供；M×3000P熒光定量PCR儀：Agilent Technologies Stratagene。

1.2 方法

1.2.1 動物模型 用隨機數字表法將50只大鼠分為正常組、假手術組、模型組、中藥組、西藥組，每組10只，分籠飼養。

模型組：參照文獻[3-4]制備AMI大鼠模型。鹽酸戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉。經口氣管插管行小動物呼吸機輔助呼吸，有氧正壓通氣，潮氣量5~6 ml，吸呼比1∶2，呼吸頻率80/min。連接標準12導聯，記錄大鼠心電圖。經左前胸廓旁第3、4肋間逐層開胸，暴露心臟，分離心包，在肺動脈圓錐和左心耳交界處用5-0號絲線結扎左冠狀動脈前降支(LAD)近端制成AMI模型，以心電圖出現壞死性Q波判斷為可能AMI，若無病理性Q波，則再次結扎，以提高AMI模型成功率，然后逐層縫合心腔。術后常規抗感染治療。

中藥組：制備AMI大鼠模型，術后立即給血塞通軟膠囊治療，給藥量按《藥理實驗方法學》所示劑量換算法計算[5]：200 g大鼠計量(g/kg)=人的劑量(1 g/kg?d)×0.018。每天灌胃1次，共用7 d。

西藥組：制備AMI大鼠模型，第6天腹腔注射基質細胞衍生因子-1受體阻斷劑AMD3100，5 mg/kg，余同模型組大鼠。

假手術組：大鼠經歷上述手術過程，絲線從冠狀動脈下穿過但不結扎。

正常組：不做造模處理。

1.2.2 實時熒光定量PCR檢測各組心肌組織TGF-β1mRNA、Smad3 mRNA、Smad7 mRNA表達

1.2.2.1 心肌組織總RNA的提取 心腔內注射10%氯化鉀使心臟停跳于舒張期，迅速取下心臟，去除心房大血管及心臟外結締組織，沖洗干凈，分別置于液氮中保存。左室用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋。在冰塊上切取50~100 mg的心肌組織塊，采用試劑盒提取組織的總RNA，操作按說明進行。

1.2.2.2 cDNA的合成 RNA樣品取10 μg，M-MLV反轉錄酶1 μl，無RNase(Ribonuclease)水補足至總體積25 μl。反應條件：42 ℃ 1 h；95 ℃15 min，4 ℃10 min。得反轉錄(reverse transcription,RT)終溶液即為cDNA溶液。

1.2.2.3 實時定量PCR 每種組織均以TGF-β1mRNA和β-actin基因引物進行定量PCR反應，每管設3個復孔，在96孔PCR板中進行。TGF-β1引物序列：上游引物5'-GTG TGG AGC AAC ATG TGG AAC TCT-3'，下游引物5'-TTG GTT CAG CCA CTG CCG TAC CGC-3'，產物143 bp。Smad3上游引物5'-GTC AAC AAG TGG TGG CGT GTG-3'，下游引物5'-GCA GCA AAG GCT TCT GGG ATA-3'， 產物 150 bp。Smad7上游引物5'-GGA GTC CTT TCC TCT CTC-3'，下游引物5'-GGC TCAATG AGC ATG CTT-3'，產物 125 bp。內參β-actin：上游引物5'-GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TAG-3'，下游引物5'-GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG-3'，產物150 bp。反應條件：95℃，10 s；95℃，30 s；55℃，30 s。共40個循環。每例樣本反應結束后由計算機自動計算并讀出定量結果Ct值。Ct值采用2-△△Ct法進行相對定量。

1.2.3 病理形態學檢查 各組處死大鼠，取心肌組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片HE染色，在光鏡下進行病理觀察。

1.2.4 流式細胞儀檢測 大鼠麻醉后，腹主動脈采血，肝素抗凝。Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，稀釋至1×106/ml，分別加入熒光素藻紅蛋白(PE)標記的骨髓基質干細胞抗原1(CD117)抗體，流式細胞儀檢測。

1.2.5 免疫組化檢測 采用SP法，DAB顯色，在400倍顯微鏡下計數單位面積內c-kit陽性細胞數，每張切片隨機取9個視野，取其均值作為測定值，具體步驟參照試劑盒說明書。

1.2.6 統計學分析

采用SPSS 17.0統計軟件進行單因素方差分析。所得數據均用(±s)表示，顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 心肌組織病理學觀察

正常組及假手術組整體均呈現正常心肌膜組織。模型組：心肌細胞數量較少且散在，結締組織整片廣布，炎性細胞聚集，成纖維細胞多，整體呈現AMI(重癥)心肌膜組織。中藥組：心肌細胞間有大量炎性細胞聚集，整體呈現心肌炎心肌膜組織。西藥組：結締組織整片占據切片較大區域，炎性細胞散在，淺粉紅色膠原成分較多，紅細胞聚集且多，整體呈現AMI(輕癥)心肌膜組織。見圖1。

2.2 流式細胞儀檢測

模型組陽性細胞數明顯高于假手術組(P<0.01)，中藥組與西藥組均明顯高于模型組(P<0.01)，中藥組與西藥組無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

2.3 免疫組化檢測

模型組單位面積內c-kit標記陽性細胞數高于假手術組(P<0.05)，中藥組與西藥組均高于模型組(P<0.05)，中藥組與西藥組間無顯著性差異(P>0.05)。見圖2、表2。

表1 各組外周血PE標記CD117細胞數流式細胞儀檢測結果

表2 各組免疫組化c-kit標記細胞檢測結果

圖2 各組c-kit免疫組化染色(光學顯微鏡，400×)

2.4 實時熒光定量PCR檢測

模型組與假手術組相比，TGF-β1mRNA、Smad3 mRNA表達均明顯增加(P<0.01)，Smad7 mRNA表達降低(P<0.05)。中藥組和西藥組較模型組TGF-β1mRNA、Smad3 mRNA表達降低(P<0.05)，而Smad7 mRNA表達增加(P<0.05)。中藥組與西藥組比較，均無顯著性差異(P>0.05)，見表3。

表3 各組心肌組織TGF-β1mRNA、Smad3 mRNA、Smad7 mRNA實時熒光定量結果

3 討論

AMI后心肌重塑是指由于心肌嚴重缺血、壞死所導致的一系列心肌結構、功能和表型的變化，主要包括[6]：①病理性心肌細胞肥大伴胚胎性基因再表達；②心肌細胞的凋亡與壞死；③細胞外基質過度沉積或降解增加。其分子和細胞機制復雜，目前尚未完全闡明。多數研究認為信號傳導途徑參與的神經內分泌-細胞因子系統是引起心肌重塑的關鍵因素[7]。

近年來，大量研究表明，在心肌損傷修復過程中，血管緊張素Ⅱ(angiotninⅡ，AngⅡ)、β腎上腺素、內皮素等引起心肌纖維化、心肌重塑均可導致TGF-β1增加、TGF-β1/Smads信號通路過度激活，這成了諸多因素所致心肌重塑的共同通路[8]。因而，TGF-β1/Smads通路激活在AMI后的心肌重塑過程中起重要作用。最近研究表明[9-10]，BMSCs“歸巢”在AMI后心肌重塑保護效應中療效確切，因而也應是較佳的治療靶點，然而正常情況下外周血中干細胞含量很低，達不到修復壞死心肌所需的濃度。因此，西醫學治療AMI后心肌重塑，主要使用粒細胞集落刺激因子(granulocytecolony stimulating factor,G-CSF)、AMD3100、粒巨細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophag colony-stimulating factor,GM-CSF)等作為AMI后干細胞“歸巢”的有效動員劑，相關研究表明治療AMI后心肌受損的有效性確切[11-12]。本實驗證實心肌梗死后，外周血及梗死心肌區BMSCs明顯增多，ADM3100對干細胞循環有動員效應。

AMI屬中醫“胸痹、真心痛”的范疇，是血道閉塞、血脈不通、瘀血滯塞脈絡所致，以“血氣不至”、“血凝而不流”、“血瘀滯不行”等為主要病理機制，以胸悶胸痛、心悸氣短等為主要癥狀。“祛瘀生新”亦稱化舊生新、除舊生新，方而通過祛瘀、化舊或去腐等方法來祛除體內沉積的瘀血及其他陳舊性的病理產物，另一方面而強調應用生新方法來召它血、生新血、生新絡、生新物，“祛瘀”與“生新”相輔相成，不可偏廢[13]。

本實驗通過祛瘀生新法對大鼠AMI后心肌重塑的作用及對TGF-β1/Smads通路的干預后，經流式細胞儀及免疫組化檢測發現，中藥組較模型組BMSCs均明顯增多，說明祛瘀生新法對其有動員效應，也是“生新血”的具體體現；TGF-β1mRNA、Smad3 mRNA表達有所降低(P<0.05)。分子生物學檢測發現中藥組較模型組Smad7 mRNA表達增加(P<0.05)，心肌組織損傷也有所減輕，TGF-β1/Smads通路作為關鍵調控因子參與AMI后的心肌重塑過程，祛瘀生新中藥對TGF-β1mRNA、Smad3 mRNA表達的負性調節作用，同時增加Smad7 mRNA的表達，從而有效改善AMI后的心肌重塑，這可能是祛瘀生新法能抑制心肌梗死后心肌重塑的重要機制之一。至于祛瘀生新法是否還有其他的活化調控機制，還有待進一步深入研究。

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