電針阿是穴對骨骼肌損傷大鼠肌肉再生及堿性成纖維細胞生長因子表達的影響①

陳歡，張莉，崔強，盧虎英，衛肖艷

電針阿是穴對骨骼肌損傷大鼠肌肉再生及堿性成纖維細胞生長因子表達的影響①

陳歡1，張莉1，崔強2，盧虎英3，衛肖艷1

目的 觀察電針阿是穴對骨骼肌損傷大鼠腓腸肌增殖細胞核抗原(PCNA)、結蛋白(Desmin)及堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)表達的影響，探討電針阿是穴對骨骼肌損傷后肌衛星細胞增殖分化的可能機制。方法將78只雄性Sprague-Dawley大鼠隨機分為模型組6只，空白組、電針組、自然修復組各24只，每組再分為1 d、4 d、7 d、14 d 4個亞組，各6只。模型組、自然修復組與電針組采用腓腸肌鈍挫傷結合離心運動的方法造模，模型建立后，模型組取腓腸肌行HE染色，其余各組按時間點相應處理并取腓腸肌行PCNA、Desmin和bFGF免疫組化染色。結果自然修復組各時間點PCNA表達均明顯高于空白組(P＜0.01)；Desmin在損傷后1 d、14 d低于空白組(P＜0.05)，損傷后7 d高于空白組(P＞0.05)；bFGF在損傷后7 d高于空白組(P＜0.01)。電針組PCNA、bFGF與Desmin的表達在損傷后1 d、4 d均高于自然修復組(P＜0.05)。結論電針阿是穴能促進肌衛星細胞增殖，加快其成肌分化，縮短損傷修復進程，其機制可能與上調及提前bFGF的表達有關。

骨骼肌損傷；電針；阿是穴；增殖細胞核抗原；堿性成纖維細胞生長因子；結蛋白；大鼠

[本文著錄格式]陳歡，張莉，崔強，等.電針阿是穴對骨骼肌損傷大鼠肌肉再生及堿性成纖維細胞生長因子表達的影響[J].中國康復理論與實踐,2013,19(4):334-340.

當前有部分研究證明針刺可促進骨骼肌損傷后肌衛星細胞的增殖[1]，發揮再生修復的作用，但尚未有關于其分子機制的研究。堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)對肌衛星細胞的增殖具有促進作用[2]。骨骼肌結蛋白(Desmin)是肌衛星細胞成肌分化最早期的標志蛋白之一[3]。本實驗旨在通過建立大鼠骨骼肌損傷模型，觀察電針阿是穴對骨骼肌損傷后增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear anti-gen,PCNA)、Desmin及bFGF表達變化，探討電針阿是穴在促進骨骼肌損傷后肌衛星細胞增殖與分化的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 8周齡雄性Sprague-Dawley大鼠78只，體質量(200±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2006-0009]。

1.1.2 儀器 DSPT-202大鼠跑臺：杭州段氏；JY5002型電子天平：蘇州江東精密儀器有限公司；G6805-1電針治療儀：青島鑫升實業有限公司；RM2235石蠟切片機：德國萊卡公司；DH-101電熱恒溫鼓風干燥箱：北京利康科技發展有限公司；BX43顯微鏡：日本OLYMPUS公司；Mshot MC50顯微成像系統：廣州市明美科技有限公司。

1.1.3 試劑 鼠抗bFGF抗體：上海滬峰生物技術有限公司；鼠抗Desmin、PCNA抗體、DAB顯色劑：北京中杉金橋生物研究所。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 大鼠按體重分層，隨機分為：模型組6只，空白組、電針組、自然修復組各24只，每組再隨機分為1 d、4 d、7 d、14 d組各6只。

1.2.2 動物造模 模型組、電針組與自然修復組大鼠造模前進行下坡跑訓練2次，10 min/次。骨骼肌損傷模型的建立采用多次機械沖擊鈍挫傷[4]與離心運動[5]結合的方法。20%烏拉坦溶液按0.5 ml/100 g行腹腔注射麻醉后，剪除大鼠雙下肢腓腸肌處被毛。大鼠俯臥位并保持踝關節跖曲呈90°使腓腸肌位于脛腓骨內側。腓腸肌肌腹中點做標記，予以3次連續打擊。打擊器總質量為500 g，由48 cm處自由落體，垂直打擊標記部位，打擊器與腓腸肌接觸面積約為1×1 cm，動能為2.352 J[6]。觀察打擊部位無骨折，表皮無破損，有散在紅色斑點，皮下暗紅。第2天，令大鼠于-16°的電動跑臺上進行持續性下坡跑訓練，速度16 m/min，持續90 min，運動過程中使用聲音和機械刺激驅趕。如此每周進行機械沖擊鈍挫傷與下坡跑1次，連續4周。

1.2.3 處理方法 ①電針組：以局部打擊點(即腓腸肌肌腹的中點)為針刺部位，電針頻率為2/10 Hz的疏密波，電流強度1～2 mA，持續20 min，1次/d，6 d/周。②自然修復組：與電針組同步抓取與固定，但不做電針處理。③空白組：不做任何處理，與電針組和自然修復組同步取材。模型組：造模完成后不做任何處理。

1.2.4 取材 模型組在最后一次造模完成后取材，其他各組動物分別于模型建立后1 d、4 d、7 d、14 d取材。20%烏拉坦溶液0.5 ml/100 g行腹腔注射麻醉。無菌操作，剔除皮毛、筋膜暴露分離出腓腸肌，銳性切取腓腸肌肌腹中段的病灶組織，寬度、厚度約1 cm。生理鹽水沖洗，4%多聚甲醛溶液漂洗，后置于4%多聚甲醛溶液固定48 h以上，行石蠟包埋。

1.2.5 骨骼肌HE染色 4%多聚甲醛溶液固定滿意后，清水沖洗，常規梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)脫水，石蠟包埋，連續切片，制成6 μm左右的切片，二甲苯脫蠟，經各級乙醇(70%、80%、90%、95%、100%)至水洗。蘇木素染色5 min，自來水沖洗；鹽酸乙醇分化30 s(提插數下)，自來水浸泡15 min，置伊紅液2 min，脫水、透明，樹膠加蓋玻片封固。光鏡下觀察組織結構變化。

1.2.6 骨骼肌PCNA、Desmin和bFGF免疫組化染色

將固定滿意的骨骼肌標本制成石蠟切片(方法同上)。免疫組化抗原染色程序按下述進行：65°烤片6 h，常規二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，雙蒸水沖洗以封閉內源性過氧化氫酶，沖洗、熱修復抗原(其中Desmin無需熱修復)，PBS沖洗封閉，4°孵育14 h，加一抗、二抗、DAB顯色，顯微鏡下觀察，出現棕黃色后即把切片放入自來水中終止反應。自來水沖洗，蘇木素復染、鹽酸酒精，氨水返藍，脫水透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察、采集圖像。采用IPP 6.0(Image-professional plus 6.0)軟件進行圖像分析。

PCNA的結果判斷方法：成肌細胞的PCNA陽性染色模式為胞核著色，呈淺黃色至棕黃色顆粒。染色判斷標準：陰性不著色，弱陽性呈淡黃色，陽性呈黃色，強陽性呈棕黃色或棕色。陽性細胞計數方法：光鏡下，利用無偏體視學(unbiased stereology)技術，全視野無偏采樣方法每張切片選取5個視野，采用IPP圖像分析軟件計算每個視野的陽性細胞率，求均值得出該樣本的陽性細胞率。

Desmin結果判定標準：Desmin的陽性染色模式為胞漿著色，橫向切片呈網狀形式分布，縱向切片中，呈細長、橫紋的規則排列，延伸并橫穿于整條肌纖維。染色判斷標準：陰性胞漿未見著色，弱陽性胞漿呈黃色，顯色高于背景，強陽性胞漿內棕黃色或棕褐色，顯色明顯高于背景。光鏡下，利用無偏體視學技術，全視野無偏采樣方法每張切片選取5個視野，進行圖像分析，測量每個視野中Desmin表達陽性區域的平均光密度(OD)，求均值得到該樣本的OD值。

bFGF結果判定標準：bFGF的陽性染色模式為胞漿與胞膜著色，呈現黃色或棕黃色顆粒。染色判斷標準：陰性胞漿或細胞膜未見著色，弱陽性胞漿內顆粒較細，呈淡黃色，顯色高于背景，強陽性胞漿內陽性顆粒粗而多，呈棕黃色甚至棕褐色，顯色明顯高于背景。光鏡下，利用無偏體視學技術，全視野無偏采樣方法每張切片選取5個視野，進行圖像分析，測量每個視野中bFGF表達陽性區域的平均光密度(OD)，求均值得到該樣本的OD值。

1.3 統計學分析

應用SPSS 17.0軟件進行統計學處理。各組數據以 (±s)表示。組間差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較用LSD-t檢驗。顯著性水平α＝0.05。

2 結果

2.1 模型評定

肉眼觀察：模型組大鼠小腿后側約當腓腸肌中點處，表皮完好無破損，皮色暗紅，有數個小瘀點。剪除表皮可見皮下筋膜增生、變硬，暴露腓腸肌可見局部肌肉有淤血，按之腫脹，并有輕度硬結。

光鏡觀察：

正常肌細胞橫切面：呈規則的多邊形，大小均勻，排列整齊，肌纖維間隙大小一致，肌細胞核位于細胞邊緣，且每個肌細胞可見到幾個細胞核排列(圖1)；

正常肌細胞縱切面：肌纖維為排列緊密而規律的縱向纖維，肌纖維粗細均勻，肌束之間間隙大小一致，肌細胞核排列于每個肌纖維膜下(圖1)；

模型組大鼠橫切面：肌細胞增大、形狀、大小不規則，可見增大的肌細胞周圍伴有相對較小的不規則形狀的肌細胞(圖2)，肌細胞之間間隙變大；

模型組大鼠縱切面：肌纖維斷裂，排列紊亂，肌纖維呈現大量的炎細胞浸潤，結締組織增生(圖2)。

2.2 腓腸肌PCNA、Desmin和bFGF免疫組化結果

2.2.1 PCNA 空白組PCNA表達很少，電針組與自然修復組PCNA表達在損傷后均明顯高于空白組(P＜0.01)。損傷后1 d電針組PCNA表達明顯高于自然修復組(P＜0.01)，4 d仍然高于自然修復組(P＜0.05)，7 d、14 d，電針組PCNA表達略高于自然修復組，但無顯著性差異(P＞0.05)。見表1、圖3。

2.2.2 Desmin 空白組Desmin表達維持在一個相對穩定的水平。損傷后1 d，電針組與自然修復組均明顯低于空白組(P＜0.01)，其中電針組高于自然修復組(P＜0.01)；損傷后4 d，電針組高于空白組(P＜0.05)與自然修復組(P＜0.01)，自然修復組仍低于空白組(P＜0.05)；損傷后7 d，電針組略高于空白組(P＜0.05)，與自然修復組無顯著性差異，自然修復組與空白組無顯著性差異；損傷后14 d，電針組高于自然修復組(P＜0.05)，與空白組無顯著性差異，自然修復組低于空白組(P＜0.05)。見表2、圖4。

2.2.3 bFGF 空白組有bFGF表達。損傷后1 d，電針組高于自然修復組(P＜0.05)；損傷后4 d，電針組與自然修復組均高于空白組(P＜0.01)，電針組高于自然修復組(P＜0.05)；損傷后7 d，電針組與自然修復組兩者均明顯高于空白組(P＜0.01)，但兩組之間無顯著性差異；損傷后14 d，各組之間均無顯著性差異。見表3、圖5。

表1 骨骼肌PCNA陽性細胞率(%)

表2 骨骼肌Desmin表達平均光密度值

表3 骨骼肌bFGF表達平均光密度值

圖1 正常組肌細胞(200×)

圖2 模型組肌細胞(200×)

圖3 PNCA免疫組化染色

圖4 Desmin免疫組化染色

圖5 bFGF免疫組化染色

3 討論

3.1 骨骼肌損傷后PCNA、Desmin及bFGF表達變化的相關性

肌衛星細胞是骨骼肌損傷后肌細胞再生之源。正常情況下，肌衛星細胞位于肌細胞基膜和肌膜之間，處于休眠狀態，無再生作用。當肌肉受到損傷性刺激后，肌衛星細胞被激活、增殖與分化，參與肌肉組織再生與修復。

PCNA又稱細胞周期蛋白(cyclin)，該蛋白在處于靜止期的細胞中含量很少，幾乎無表達。骨骼肌損傷后，肌衛星細胞被激活，細胞進入G1晚期，此蛋白開始增加，S期達到高峰，故PCNA的原位檢測常用來評價肌衛星細胞的增殖狀態[7]。

Desmin是一種肌肉特異性中間絲蛋白，是較早表達的肌源性標志蛋白之一[3]。Desmin位于肌節Z線周圍，連接相鄰肌原纖維Z線和肌纖維膜，可限制肌節在肌肉收縮時被過分牽拉，在維持肌節完整性中起保護作用[6]。Desmin在正常肌纖維中有分布，肌肉損傷后由于骨架蛋白的缺失導致Desmin表達迅速下降，2～3 d后肌衛星細胞再生分化為具有肌肉特性的肌纖維后Desmin表達增加，7 d左右達到峰值，2～4周后逐漸恢復到正常水平[8]。因此，Desmin免疫組化染色可作為評估骨骼肌早期損傷，以及再生肌細胞成肌分化的指標[9]。

損傷發生后，被激活的肌衛星細胞可受到多種因子的調控而增殖與分化，bFGF即屬于其中一種。成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)是一類對成纖維細胞系BALB/c3T3的分裂增殖具有促進效應的多肽。FGF家族均具有促增殖和抗損傷、促修復作用，而bFGF在抗組織損傷和促進修復方面作用最強[10]。研究證明，內源性[11]與外源性[12]的bFGF均可促進骨骼肌衛星細胞的增殖與分化。骨骼肌自身具有分泌bFGF的作用，其分泌后儲存于骨骼肌纖維內膜[13]。當骨骼肌損傷后，肌細胞膜破裂導致bFGF的逐漸釋放[14]，其通過趨化巨噬細胞等炎癥細胞到損傷局部吞噬壞死組織，而巨噬細胞的應答同時加快肌衛星細胞的增殖。另一方面損傷后巨噬細胞、成纖維細胞均具有分泌bFGF的功能，這些細胞增生與滲出的細胞成分亦成為損傷后bFGF持續表達的來源之一。

本實驗結果顯示，自然修復組大鼠鈍挫傷結合離心運動后，腓腸肌PCNA、Desmin及bFGF均發生了時序性變化。損傷后1 d PCNA原位表達增高提示肌衛星細胞被激活而發生增殖，損傷后4 d達峰值，此后逐漸下降，但在損傷后14 d仍可見少數增殖現象，這一變化趨勢與Riuzzi等[2]研究結果基本一致。增殖的肌衛星細胞最終能否發揮再生修復作用與其成肌分化能力密切相關。如圖4b所示，本實驗自然修復組損傷早期可見Desmin的表達缺失(P＜0.01)，損傷后4 d、7 d Desmin表達逐漸上升，與空白組無顯著性差異，這表明損傷后4 d增殖的肌衛星細胞逐漸向肌纖維分化。損傷后14 d Desmin的表達逐漸下滑，這一方面可能與肌衛星細胞增殖幅度下降有關，另一方面可能與本實驗模型方法有關。有研究認為有損傷經歷的肌肉容易引起Desmin的再次缺失[15]。本實驗大鼠腓腸肌遭受反復性損傷，這可能是導致Desmin在損傷后14 d仍無法達到正常水平的原因。

bFGF表達的時序性變化趨勢與姚燕等[16]研究相近，空白組大鼠腓腸肌有少量bFGF表達，損傷發生后bFGF的表達有所下降，之后逐漸升高。在損傷早期(即1～4 d)，bFGF的表達與肌衛星細胞的增殖呈現同步升高的趨勢，在損傷后7 d bFGF表達仍持續升高，但是PCNA的表達卻逐漸下降，這提示bFGF促進肌衛星細胞增殖主要發生在損傷早期。

3.2 電針阿是穴對骨骼肌損傷后肌衛星細胞增殖分化的調控及其可能的相關分子機制

在損傷后1 d、4 d，電針組PCNA、Desmin陽性表達均較自然修復組高，且有統計學意義，這提示電針可以促進損傷早期肌衛星細胞的增殖與成肌分化。在損傷后14 d，電針組Desmin的表達高于自然修復組(P＜0.05)，并且與空白組無顯著性差異，這提示電針可以使損傷組織提前恢復到正常水平。

損傷后1 d、4 d，電針組bFGF表達高于自然修復組(P＜0.05)，這提示電針可以上調bFGF表達。損傷后7 d，自然修復組高于空白組(P＜0.01)，而電針組在損傷后4 d bFGF的表達高于空白組(P＜0.01)，這提示電針可以使bFGF的表達提前升高。此前有研究證明bFGF在損傷早期促進肌細胞增殖作用較明顯[12]。因此，電針上調和提前bFGF的表達屬于一種良性促進作用。

4 結論

大鼠骨骼肌鈍挫傷結合離心運動后，肌衛星細胞可出現增殖，并發生成肌分化，bFGF與肌細胞再生與成肌分化有關。電針阿是穴可促進骨骼肌損傷后肌衛星細胞的增殖與成肌分化，并且縮短損傷再生與修復時程。電針可提前并且上調骨骼肌損傷后bFGF的表達，這可能是電針促進損傷后肌衛星細胞增殖的機制之一。

本實驗尚存在不足之處，即缺乏對損傷后炎癥反應的觀察。由于在損傷過程中，bFGF促進肌衛星細胞的增殖主要以早期為主，與炎癥反應關系密切。因此，通過對損傷后炎癥反應的觀察，可更進一步探討電針對肌肉再生的作用機制。

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Effects of Electroacupuncture at Ouch Point on Muscle Regeneration and Basic Fibroblast Growth Factor Expression in Skeletal Muscle Damaged Rats

CHEN Huan,ZHANG Li,CUI Qiang,et al.School of Acupuncture,Moxibustion and Tuina,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China

ObjectiveTo observe the effects of electroacupuncture at Ouch Point on proliferation cell nuclear antigen(PCNA),Desmin and basic fibroblast growth factor(bFGF)expression in gastrocnemius muscle,and explore the possible mechanisms of the effect.Methods78 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into model group(n=6),blank group(n=24),self-repair group(n=24)and electroacupuncture group(n=24).Each of the later 3 groups was divided into 1 d,4 d,7 d and 14 d subgroups,6 rats in each subgroup.The model group,self-repair group and electroacupuncture group were modeled by gastrocnemius muscle crush injury combined with eccentric exercise-induced injury.After that,the model group given HE stain,and the other groups were given correspondent approach according to time point and immunohistochemical technology was used to test the expression of PCNA,Desmin and bFGF.ResultsPCNA expression was higher in the self-repair group than in the blank group at each time point(P＜0.01).Desmin expression was lower in the self-repair group than in the blank group 1 d and 14 d after injury(P＜0.05),but higher 7 d after injury(P＞0.05).bFGF expression was higher in the self-repair group than in the blank group 7 d after injury(P＜0.01).PCNA,bFGF and Desmin expression were higher in the electroacupuncture group than in the self-repair group 1 d and 4 d after injury(P＜0.05).ConclusionElectroacupuncture at Ouch Point can promote the proliferation of muscle satellite cells,accelerate the myogenic differentiation and shorten the repair process,which may be related to the increased and advanced expression of bFGF.

skeletal muscle damage;electroacupuncture;Ouch Point;proliferating cell nuclear antigen;basic fibroblast growth factor; Desmin;rats

R681

A

1006-9771(2013)04-0334-07

2012-10-29)

1.國家自然科學基金(No.81141120)；2.高等學校博士學科點專項科研基金(No.20100013110014)。

1.北京中醫藥大學針灸推拿學院，北京市100029；2.陜西中醫醫院，陜西西安市710003；3.中國康復研究中心北京博愛醫院，北京市100068。作者簡介：陳歡(1984-)，女，福建漳州市人，博士研究生，主要研究方向：針灸臨床機理研究。通訊作者：張莉。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.04.005