丙戊酸鈉誘導孤獨癥模型大鼠皮層Bcl-2、Bax的表達①

姜志梅，崔利軍，郭津，張士嶺，郭嵐敏

丙戊酸鈉誘導孤獨癥模型大鼠皮層Bcl-2、Bax的表達①

姜志梅1a,1b,1c，崔利軍1b，郭津1c，張士嶺1c，郭嵐敏1a

目的 探討Bcl-2、Bax在孤獨癥發病中的作用。方法孕12.5 d Sprague-Dawley孕鼠腹腔注射丙戊酸鈉600 mg/kg建立子代孤獨癥模型大鼠，對照組注射同等劑量生理鹽水。利用尼氏染色、免疫組化和圖像分析技術觀察比較出生后1 d、7 d、14 d、28 d和56 d兩組大鼠腦部Bcl-2、Bax表達。結果尼氏染色：出生后1 d、7 d模型組神經元數量較少，出生14 d后劇增，出生后28 d、56 d仍高于對照組。免疫組化：出生后1～14 d兩組Bcl-2、Bax表達均顯著升高(P＜0.001)，出生28后表達趨于穩定(P＞0.05)；與對照組相比，模型組各日齡大鼠Bcl-2表達水平均顯著降低(P＜0.001)；Bax于出生后1 d、7 d表達顯著升高(P＜0.001)，出生后14 d表達顯著降低(P＜0.001)，出生28 d后水平相似(P＞0.05)。對照組Bcl-2/Bax值出生后1 d最大，隨年齡逐漸減小，出生14后趨近于1。模型組Bcl-2/Bax值出生后7 d最低，14 d最高，28 d后趨于穩定。結論孤獨癥模型大鼠大腦皮層神經元細胞抗凋亡能力下降，尤其在出生后早期。

孤獨癥；凋亡；Bcl-2；Bax；大鼠

[本文著錄格式]姜志梅，崔利軍，郭津，等.丙戊酸鈉誘導孤獨癥模型大鼠皮層Bcl-2、Bax的表達[J].中國康復理論與實踐, 2013,19(5):432-436.

細胞程序性死亡是一個正常的生理過程，是機體個體發育過程中不可缺少的步驟。在神經系統正常發育過程中，超過50%的細胞發生凋亡[1]。B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma leukemia-2,Bcl-2)是凋亡調控家族中的重要成員，發揮抗凋亡作用。在細胞內與Bcl-2以同源二聚體或異源二聚體的形式存在的Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)具有促凋亡作用。

孤獨癥是一種神經發育障礙性疾病。有尸檢研究報道[2-3]，孤獨癥患者額葉及小腦組織中Bcl-2表達減少，Bax表達增加。本實驗通過構建丙戊酸鈉誘導孤獨癥模型大鼠，應用免疫組化和圖像分析技術檢測大鼠大腦皮層中Bcl-2和Bax的表達，探討Bcl-2和Bax在孤獨癥發病過程中的變化規律及意義。

1 材料與方法

1.1 材料

丙戊酸鈉(sodium valproate,VPA)：美國SIGMA公司；兔抗大鼠多克隆Bcl-2抗體、兔抗大鼠多克隆Bax抗體：北京博奧森公司；山羊抗兔IgG、SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒：武漢博士德公司；OLYM PUS CH30光學顯微鏡及自動成像系統：日本OLYM PUS；Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件。

成年健康清潔級Sprague-Dawley大鼠，大連醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXX(遼) 2008-0002。雌性30只，體重280～320 g，雄性15只，體重320～350 g。在佳木斯大學實驗動物飼養中心清潔級大鼠飼養室(光照、溫度、濕度適宜)飼養1周，使之適應環境。

1.2 造型及分組

實驗大鼠每日下午4:00雌雄2∶1合籠過夜，次日晨8:00行陰道分泌物涂片，查到精子當日記為妊娠第1天，孕鼠與雄鼠分籠飼養。按照受孕順序為孕鼠進行編號(1～30號)，利用隨機數字表，將孕鼠隨機分為2組：模型組24只，對照組6只。參照Rodier[4]和Schneider[5]等的方法，模型組孕12.5 d時腹腔注射250 mg/ml丙戊酸鈉溶液600 mg/kg，對照組注射等量生理鹽水。模型組孕鼠產下仔鼠記為VPA組，對照組孕鼠產下仔鼠記為NS組。

1.3 取材及染色

分別取VPA組、NS組出生后1 d、7 d、14 d、28 d和56 d大鼠各3只，斷頭取腦，用蒸餾水沖洗后放入4%多聚甲醛中固定，腦組織與甲醛體積比為1∶4，保存于4℃冰箱。

鼠腦修塊，流水沖洗24 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋。石蠟切片，厚4～6 μm。每個樣本取3張切片，常規脫蠟水化，常溫浸入焦油紫染液染色20 min，蒸餾水洗滌；晾干，中性樹膠封片，鏡檢。尼氏體染為紫色。

免疫組化染色：取石蠟切片，常規脫蠟水化，微波修復3 min，冷卻2～3 h，PBS清洗3次，每次5 min，3%過氧化氫清洗10 min，PBS清洗3次，每次5 min，抗原修復，PBS清洗3次，每次5 min，5% BSA封閉，37℃孵育30 min，甩去封閉液，直接滴加一抗(Bcl-2、Bax)，4℃過夜。次日PBS清洗3次，每次5 min，滴加二抗37℃孵育30 min，PBS清洗3次，每次5 min，滴加SABC 37℃孵育30 min，PBS清洗4次，每次5 min，滴加DAB顯色液，鏡下控制顯色時間，封片后鏡檢。

每個樣本取3張切片，100倍光鏡下定位，400倍光鏡下采集3個不重疊視野，利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分別計算Bcl-2、Bax免疫陽性細胞的積分光密度(integrated optical density,IOD)值。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 尼氏染色

VPA組大鼠皮層神經元數量先減少后增加：出生后1 d、7 d時VPA組神經元排列較稀疏，神經元數量較少；14 d后，VPA組神經元排列緊密，面積小，神經元數量較之前劇增。28 d、56 d時VPA組神經元數量仍高于NS組。兩組神經元形狀無明顯差別。見圖1。

2.2 Bcl-2

隨年齡增長，NS組大鼠大腦皮層Bcl-2表達逐漸減少，出生28 d后趨于穩定；VPA組Bcl-2表達趨勢與NS組相同，但各日齡Bcl-2表達水平均較NS組顯著下降(P＜0.001)。見表1。

表1 各組Bcl-2表達水平(IOD)

2.3 Bax

隨年齡增長，NS組大鼠大腦皮層Bax表達逐漸減少，出生28 d后表達趨于穩定。VPA組Bax表達趨勢與NS組相同，但1 d、7 d時，VPA組表達顯著高于NS組(P＜0.001)；14 d時，VPA組顯著低于NS組(P＜0.001)；28 d后，兩組間無顯著性差異(P＞0.05)。見表2。

表2 各組Bax表達水平(IOD)

圖1 仔鼠腦組織尼氏染色

2.4 Bcl-2/Bax比值

NS組大鼠大腦皮層Bcl-2/Bax比值出生后1 d時最大，隨年齡逐漸減小，14 d后趨近于1。VPA組大鼠Bcl-2/Bax比值7 d時最低，14 d時最高，28 d后趨近于穩定。見表3。

表3 各組Bcl-2/Bax比較

3 討論

人類妊娠20～24 d是神經管閉合和腦神經運動核形成的關鍵時期，相當于大鼠胚胎12～14 d。丙戊酸鈉是一種廣譜的抗癲癇藥物，通過增加抑制性神經遞質γ-氨基丁酸(GABA)的合成，并減少其降解，最終升高GABA濃度，降低神經元興奮性。有研究顯示，近30%的孤獨癥患兒，其母親在妊娠3～4周時服用過鎮靜類藥物[6]。Rodier等運用丙戊酸鈉處理孕12.5 d雌鼠，較好地在子代復制出類似孤獨癥癥狀，且在子代幼鼠腦區檢測出如小腦后葉體積減小、浦肯野細胞減少等類似孤獨癥的組織結構變化[4]。目前，利用丙戊酸鈉處理孕鼠構建孤獨癥動物模型被公認為是較成熟的動物模型[7-9]。

孤獨癥是一種神經發育障礙性疾病。學者們普遍認為，孤獨癥患者存在神經元成熟、分化、遷移、凋亡等障礙。Bcl-2和Bax是凋亡調節基因Bcl-2家族的兩個重要成員，發揮抗凋亡或促凋亡的作用。Bcl-2表達上調時，增強抗凋亡作用；Bax是促凋亡因子，表達增加時促進凋亡。據報道，Bcl-2/Bax比值在確定生后中樞神經系統神經元凋亡方面起著重要作用[10-11]：Bcl-2/Bax比值越大，神經元細胞抗凋亡能力越強。

本研究顯示，孤獨癥模型大鼠出生后，早期(出生后1 d和7 d)Bcl-2表達減少，Bax表達增加，Bcl-2/Bax比值＜1；同時尼氏染色顯示，孤獨癥模型大鼠在出生后，早期神經元數量減少。神經元數與Bcl-2/Bax在時間存在一定聯系。

尸檢研究顯示，孤獨癥患者前額葉皮層Bcl-2表達水平下降38%，小腦皮層下降36%[2,12]。本研究結果與臨床某些研究結果相吻合：孤獨癥患兒出生后2～4年間出現異常的腦生長過度，腦體積在3～5歲達到最大值，比正常兒童提早6～10年[13-14]。MRI研究顯示，孤獨癥患兒腦組織在經過一段相對較快的過度生長期后，會進入減緩期甚至發育停滯[15-16]。無論是腦組織的過度生長，還是發育停滯，均提示神經元的細胞周期紊亂。有研究發現，Bcl-2和Bax在調節細胞周期方面也發揮一定的作用[17]：Bcl-2過表達細胞主要阻滯在G0/G1期，Bax表達上調可加速進入S期。

神經元異常凋亡、過度發育與細胞周期紊亂之間是如何聯系的，在孤獨癥的發病過程中具有什么作用？這些問題需要我們進一步研究探索。

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Expression of Bcl-2 and Bax in Cerebral Cortex of Sodium Valproate Induced Autism Rats

JIANG Zhi-mei,CUI Li-jun,GUO Jin,et ɑl.The Third Affiliɑted Hospitɑl of Jiɑmusi University,Jiɑmusi 154007,Heilongjiɑng,Chinɑ

ObjectiveTo explore the role of Bcl-2 and Bax in pathogenesis of the autism.MethodsFemale Sprague-Dawley rats were given a single intraperitoneal injection of sodium valproate(VPA,600 mg/kg)on 12.5 d after pregnancy,their offspring were as the model group;while the other pregnancy rats were given normal saline,their offspring were as the control group.Both groups were observed with the Nissl staining,immunohistochemistry of Bcl-2 and Bax and image analysis 1 d,7 d,14 d,28 d,56 d after birth.ResultsCompared with the control group,Nissl staining showed the number of cortical neurons decreased on 1 d and 7 d after birth in the model group,rapidly increased on 14 d after birth,and maintained in high level on 28d,56 d after birth.For immunohistochemistry,the integrated optical density (IOD)of Bcl-2 and Bax decreased in cortex on 1～14 d after birth(P＜0.001)in both groups,and were stable 28 d after birth(P＞0.05).Compared with the control group,the IOD of Bcl-2 decreased much more at every time point(P＜0.001)in the model group,but the IOD of Bax increased on 1 d,7 d(P＜0.001),decreased on 14 d(P＜0.001),similar 28 after birth(P＞0.05).The ratio of Bcl-2/Bax was the most on 1 d after birth,and then decreased to approximately 1 in the control group,while it was the least on 7 d,most on 14 d,and decrease to less than 1 28 d after birth.ConclusionApoptosis of cerebral cortex neurons increases in the autism model rats,especially in the early time.

autism;apoptosis;Bcl-2;Bax;rats

R749.93

A

1006-9771(2013)05-0432-04

2013-03-10

2013-04-04)

黑龍江省研究生創新科研項目(No.YJSCX2012-370HLJ)。

1.佳木斯大學，a.第三附屬醫院兒童保健科；b.康復醫學院；c.兒童神經康復實驗室，黑龍江佳木斯市154007。作者簡介：姜志梅(1966-)，女，漢族，黑龍江佳木斯市人，博士研究生，主任醫師，教授，碩士研究生導師，主要研究方向：兒童腦發育與行為障礙。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.05.09