小鼠腦缺血/再灌注后細胞周期相關蛋白在神經(jīng)元的表達規(guī)律

喬海兵，尚君璟，接 近，蘭依娜，趙 亮，史志遠，石 靜(山西醫(yī)科大學汾陽學院解剖學教研室，汾陽0300;山西醫(yī)科大學汾陽學院)

缺血性腦血管疾病是危害人類生命和健康的常見病和多發(fā)病，具有發(fā)病率高、致殘率高等特點。因此，對于缺血性腦血管疾病的機制和治療的研究顯得尤為重要。局灶性腦缺血后可引起繼發(fā)性腦損害，由于神經(jīng)元對缺血缺氧非常敏感，可以引起神經(jīng)元的凋亡，進而影響腦功能的恢復。本實驗就小鼠短暫性腦缺血后神經(jīng)元中細胞周期蛋白與細胞周期蛋白依賴蛋白激酶的表達規(guī)律進行研究，為臨床研究腦缺血提供形態(tài)學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物分組

選用健康雄性昆明小鼠，體重25-40 g。購自北京軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心(SCXK-(軍)2012-008)，小鼠自行攝食飲水。實驗動物隨機分為假手術組和缺血再灌注組。缺血組分缺血40 min后再灌注 3 h，5 h，12 h，1 d，3 d，5 d 共 6 組，每組 8只，假手術組每組各5只，共78只。

1.2 動物模型的建立及篩選

參照Longa等［1］的方法，建立小鼠大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)缺血模型。具體步驟如下:①10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔麻醉，8% 硫化鈉脫毛、備皮，消毒頸部皮膚。②沿頸正中線做一長度約1.5 cm的切口，分離下頜下腺，逐層分離深筋膜、肌膜及右側胸鎖乳突肌，仔細分離出右側頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，5-0絲線結扎頸外動脈。③在頸總動脈近端，頸內動脈處預置5-0絲線備用，并用止血鉗牽拉。在頸總動脈距分叉部約1-2mm處剪一“V”形小口，緩慢插入線栓(直徑為0.15 mm尼龍線用多聚賴氨酸包被，制備成長度為2 cm、頭端燒灼為約0.20 mm鈍頭的線段)，直到遇到阻力為止，插入深度以頸總動脈分叉處算起，應插入8-9 mm;插線成功后，結扎頸總動脈以止血，結扎頸內動脈以固定尼龍線。消毒并縫合切口。以上手術操作在4×手術放大鏡下進行。手術過程中小鼠的肛溫維持在(37±0.5)℃。手術結束，將小鼠改為側臥位，37℃下1 h，注意觀察其生命體征變化。缺血再灌注組，缺血40 min后，拔出尼龍線5 mm進行再灌注，根據(jù)所需的再灌注時段取腦。假手術組的手術步驟相同，但插線深度不足6 mm。

小鼠腦缺血后表現(xiàn)出相應的癥狀和體征，這些癥狀與體征既可反映腦損傷與恢復的程度，也可作為模型制作是否成功的指標。參照Zea Longa評分法［1］，于小鼠清醒后進行評分，分0-4分五級。0分:無神經(jīng)系統(tǒng)損害癥狀;1分:不能完全伸直左前爪;2分:向左側轉圈;3分:行走時向左側傾斜;4分:不能自發(fā)行走。評分在2-3分的小鼠用于本實驗。

1.3 取材與染色

選用缺血40 min再灌注1 d的腦組織迅速斷頭取腦，去除嗅球，從額極開始依次在腦前極與視交叉連線中點處、視交叉處、漏斗柄處、漏斗柄與后葉尾極之間，切成約1 mm厚的腦片。在1.5%紅四氮唑(TTC)溶液中37℃孵育30 min，將其置入4%多聚甲醛保存、照相。

1.4 冰凍切片的制作及免疫熒光雙重染色

腦組織固定后，依次浸入20%、30%蔗糖溶液中至沉底。從視交叉至腦橋前緣冠狀位切取腦組織，OCT包埋，-20℃冷凍。用冷凍切片機行20 μm連續(xù)冠狀切片，貼附于鉻明膠處理過的載玻片上。室溫干燥1 h，-20℃ 保存，待用。冰凍切片在室溫下干燥1 h，0.5%Triton X-100室溫10 min，0.01 mol/L PBS搖洗 3次，每次 5 min。用10%的正常山羊血清和兔血清在室溫下孵育45 min，同時滴加兩種不同來源的一抗(兔抗鼠NSE 1∶200/鼠抗兔 cyclin D1 1∶200，鼠抗兔 NSE 1∶200/兔抗鼠CDK4 1∶200)在濕盒中4℃ 孵育，過夜。第2天室溫復溫1 h，0.01 mol/L PBS搖洗3次，每次5 min，在暗環(huán)境下滴加異硫氰酸熒光素(FITC)和四乙基若丹明硫氰酸鹽(TRITC)標記的與一抗相對應的熒光二抗(1∶50)，在室溫孵育45 min，用0.05%TritonX-100避光搖洗，在觀察NSE/cyclinD1時，滴加0.001%DAPI對比染色，50%甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察，用激發(fā)光為490-495 nm的藍光，550 nm的綠光和紫外光觀察。

2 結果

2.1 TTC染色

小鼠腦冠狀切面右側可見較大的蒼白梗死區(qū)，與正常的腦組織(呈紅色)界限較明顯，說明動物模型成功(見圖1)。

圖1 小鼠腦缺血1 dTTC染色連續(xù)切片F(xiàn)igure 1 TTC staining of mice after ischemia for 1 d

圖2 小鼠腦缺血1 d和3 d NSE和cyclin D1的免疫熒光雙重染色 (×400)Figure 2 Double immunofluorescent staining of NSE and cyclin D1 after reperfusion for 1 d and 3 d in penumbra

圖3 小鼠腦缺血1 d和3 dNSE和CDK的免疫熒光雙重染色 (×400)Figure 3 Double immunofluorescence staining of NSE and CDK with reperfusion for 1 d and 3 d in penumbra (×400)

2.2 免疫熒光雙重染色

缺血再灌注3 h、5 h和12 h組NSE在缺血中心區(qū)和半暗帶分布，胞質著色，cyclin D1在半暗帶和皮質少量表達，有的在胞質，有的在胞核表達，熒光強度較弱，在半暗帶和缺血區(qū)有NSE與cyclin D1共同表達(圖2，見第749頁);缺血再灌注1 d，cyclin D1表達數(shù)量明顯增多(95±2.43)，與3 d組(43±1.72)、5 d組(24±3.42)比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。NSE主要分布在半暗帶，缺血中心區(qū)的NSE表達減少，主要在半暗帶表達，細胞形態(tài)有的比較完整，可見明顯的突起，有的為不規(guī)則形，缺血中心區(qū)內cyclin D1的表達也增加，細胞較小，可見綠色熒光強度強。缺血再灌注3 d，NSE和cyclin D1表達(圖2D、H，見第749頁)數(shù)量和強度都較1 d組下降，在半暗帶cyclin D1在NSE陽性細胞中表達的數(shù)量減少，缺血中心區(qū)散在可見NSE和cyclin D1共同表達。

NSE用 TRITC標記，為紅色熒光，CDK4用FITC標記，為綠色熒光。缺血再灌注3 h、5 h和12 h組NSE胞質著色，在缺血區(qū)和半暗帶均有分布，CDK4在半暗帶和皮質少量表達，有的在胞質，有的在胞核表達，熒光強度較弱，半暗帶和缺血中心區(qū)有NSE與CDK4共同表達(圖3，見第750頁);缺血再灌注1 d，NSE主要分布在半暗帶，缺血區(qū)的NSE表達減少，CDK4表達明顯增多，主要分布在半暗帶，細胞形態(tài)有的比較完整，有的為不規(guī)則形或圓形，缺血中心區(qū)內CDK4的表達也增加，細胞較小，半暗帶可見NSE與CDK4共同表達的細胞數(shù)量增多，在缺血中心區(qū)內散在可見CDK4在NSE陽性細胞中表達;缺血再灌注3 d，NSE在缺血區(qū)內的數(shù)量繼續(xù)減少，CDK4表達數(shù)量和強度都達高峰(124±2.36)，與1 d(56±1.57)、5 d組(24±3.46)比較，差異具有顯著性(P＜0.05).在半暗帶CDK4在NSE陽性細胞中表達的數(shù)量較1 d組減少;缺血再灌注5 d組，NSE在半暗帶表達為主，缺血區(qū)散在，CDK4的表達減少，在半暗帶周邊可見少量CDK4在NSE陽性細胞中表達。

3 討論

細胞周期是指連續(xù)的分裂細胞從一次有絲分裂結束到下一次有絲分裂結束，細胞由一個分裂為兩個子細胞所經(jīng)歷的整個過程。細胞周期的運行沿著G1期→S期→G2期→M期的順序進行。細胞周期的調控可分為外源性和內源性調控，外源性調控主要是由外界刺激引起的。而內源性調控主要是通過cyclins、CDKs、細胞周期蛋白激酶抑制因子(cyclinkinase inhibitor，CKI)進行網(wǎng)絡調控來實現(xiàn)［2］。在此過程中，cyclins激活相對應的CDKs，兩者瞬時結合成特定的cyclins-CDKs復合物。此復合進而激活并啟動下游蛋白因子，從而在細胞周期的各個階段發(fā)揮相應的調節(jié)作用。CKIs在CDKs活化、cyclins/CDKs復合物形成以及該復合物激活下游因子的過程中，通過抑制CDKs來發(fā)揮其重要的調節(jié)作用。在G1/S期發(fā)揮主要作用的是cyclin D，其與CDK4或CDK6結合形成復合物而發(fā)揮作用，在G1期進入S期過程中起重要調節(jié)作用。

一般認為成熟的神經(jīng)元是終末分化細胞，沒有增殖能力，可以長期處于G0期。在正常神經(jīng)元中cyclin D1和CDK4含量很少，大部分在胞質表達。近些年來研究發(fā)現(xiàn)，當神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷時，細胞周期相關蛋白在神經(jīng)元中表達增多。

細胞的增殖、分化、死亡都是被細胞周期相關蛋白和它們之間的相互調節(jié)而精確地控制著，一旦這種調節(jié)被打破，周期相關蛋白可能會啟動信號轉導途徑而導致細胞的死亡。體外實驗，cyclin D1已經(jīng)被認為是凋亡的標記:體外培養(yǎng)成年大鼠的交感神經(jīng)細胞，在撤除NGF后cyclin D1表達可誘導凋亡［3］。用順鉑處理背根神經(jīng)節(jié)細胞后，在凋亡的神經(jīng)元中表達 cyclin D1［4］。但在體內實驗中，關于cyclin D1和CDK4對缺血后神經(jīng)元的作用看法不一。有人認為腦缺血后細胞周期相關蛋白的表達以其在凋亡機制中的作用為主，而不是在細胞周期中的作用，部分凋亡是由于細胞周期的異常調控所致［5］。

有研究［6，7］發(fā)現(xiàn)在大鼠缺血再灌注模型中，G1/S期相對應的cyclin D1和CDK4上調，可能對于缺血再灌注引起的腦損傷導致神經(jīng)元的凋亡有重要的作用。Li等［7］認為在大鼠缺血2 h的局灶性腦缺血模型中，cyclin D1和CDK4在神經(jīng)元和少突膠質細胞中表達，凋亡的細胞不表達cyclin D1和CDK4。說明細胞周期蛋白對于神經(jīng)元的細胞分裂可能沒有作用，但可能對于細胞的存活有作用。不可再生的神經(jīng)元表達cyclin D1和CDK4可能對于修復DNA有作用，而不是使細胞重新進入細胞周期或凋亡。國外學者［8-10］發(fā)現(xiàn)，在全腦缺血模型中當神經(jīng)元損傷時，微管相關蛋白-2(microtubule-associated protein-2，MAP-2)和cyclin D1的表達都下調。二者在沒有神經(jīng)元損傷的區(qū)域包括CA3區(qū)和齒狀回的表達都沒有變化，cyclin D1對神經(jīng)元的存活和凋亡都沒有作用，但對于非神經(jīng)元可能有。

本實驗用熒光雙重染色觀察小鼠局灶性腦缺血后，cyclin D1在神經(jīng)元中的表達1 d達高峰，以后表達逐漸下調。CDK4在神經(jīng)元中的表達1 d天后增加，3 d天達高峰，5 d后下調，且兩者主要在半暗帶的神經(jīng)元中表達。結果提示缺血導致細胞周期相關蛋白在成體的神經(jīng)元中表達，如果神經(jīng)元損傷程度低于死亡的閾值時，cyclin D1與CDK4結合形成的復合物可能會誘導修復損傷的DNA，但如果神經(jīng)元缺血時間較長，DNA難以修復，就會引起神經(jīng)細胞不可逆的調亡。

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