兔心房組織L型鈣通道表達的增齡性變化及卡托普利的干預作用

韓新源，陳春燕，壽錫凌，程 功，潘軍強，孫超峰(陜西省人民醫(yī)院心內(nèi)科，西安 70068;西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科;通訊作者，E-mail:csunl@63.com)

心房顫動(房顫)是臨床上最常見的心律失常之一，其發(fā)病率隨著年齡的增長而增加，增齡成為房顫發(fā)生的一個重要危險因素［1］。但增齡性房顫的發(fā)病機制復雜，目前尚未完全明確。心房電重構是房顫發(fā)生和維持的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，房顫時L型鈣通道的變化在電重構過程中發(fā)揮重要作用［2］。隨著衰老的過程，L型鈣通道在心房表達是否會隨著年齡改變而改變，目前尚不清楚。藥物治療是目前房顫治療最主要的方式，而傳統(tǒng)的抗心律失常藥物由于其同時具有致心律失常的問題，在房顫治療中的地位備受爭議。鑒于此，房顫的上游治療即改善房顫基質(zhì)越來越受到重視［3］。房顫發(fā)生和維持基質(zhì)主要是心房重構，已有大量研究證實腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAS)的激活與房顫心房重構的發(fā)生、發(fā)展有關，RAS抑制劑可以降低房顫的發(fā)生率［4］。因此，本研究通過觀察不同年齡段家兔心房組織L-型鈣通道表達的增齡性改變，以及卡托普利對老年家兔心房組織L-型鈣通道表達的影響，來初步探討增齡性房顫發(fā)生機制及防治策略。

1 材料和方法

1.1 動物分組及給藥

健康家兔分為三組:成年組(4-6月齡)、老年組(30-34月齡)、老年干預組(30-34月齡)，每組8只。老年干預組以卡托普利5.5 mg/(kg·d)(商品名:開博通，百時美施貴寶公司生產(chǎn))用生理鹽水稀釋后灌胃給藥8周;老年組以等容量的生理鹽水灌胃8周。實驗動物由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.2 體表心電圖檢測

家兔麻醉后，記錄體表Ⅱ?qū)碾妶D，采用分析軟件測量心率(HR)和P波時限，包括最大P波時限(Pmax)、最小 P波時限(Pmin)，計算 P波離散度(Pd)、P波平均時限(Pa)。

1.3 心房組織AngⅡ的測定

稱取100 mg的心房組織，將組織加入適量的生理鹽水搗碎。2 000×g離心10 min，取上清液。采用兔(Rabbit)血管緊張素Ⅱ(ANG-Ⅱ)ELISA檢測試劑盒(R＆D公司，美國)測定心房組織AngⅡ的含量，實驗按照說明書進行。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄及real-time PCR檢測mRNA表達

取100 mg左心耳組織，用Trizol(Invitrogen公司，美國)一步法提取總RNA。應用紫外光分析的方法檢測所提取的總RNA的濃度及其OD260mm/OD280mm的比值，所有樣本的 OD260mm/OD280mm值在1.8-2.0之間。cDNA合成:取2 μg總RNA參照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物公司)進行操作逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。②引物由北京三博遠志生物科技公司合成，序列如下:L-Ca α1C:上游:5’-GACTCCACTTTCACCCCC-3’，下游:5’-TCTCCCCCTTGATTCTTCTGCC-3’;GAPDH:上 游:5’-GCTTTTAACTCTGGCAAAGTG-3’，下游:5’-GATGATGACCCTTTTGGCTC-3’。按照TaKaRa real-time PCR試劑盒操作說明進行反應，采用兩步法PCR擴增程序，第一步預變性95℃ 30 s 1個循環(huán)，第二步PCR反應95℃ 5 s，59.5℃ 30 s 40個循環(huán)。擴增曲線完成后自動生成融解曲線，反應完成后確認擴增曲線和融解曲線。根據(jù)Bio-Rad iQ5 Realtime PCR儀軟件得出各個樣本的Ct值，按照2-ΔΔCt法計算各個基因的相對表達量。

1.5 Western blot檢測蛋白表達

提取組織中總蛋白并檢測總蛋白含量:取20 μl樣品/泳道上樣于10%SDS-PAGE進行凝膠電泳;4℃電轉(zhuǎn)膜90 min。TBST封閉1 h，洗脫后加入一抗1∶800(抗 L-Ca α1C，Abcam)及內(nèi)參 1∶1 000(抗 βactin，Santa Cruz)，4℃過夜。TBST漂洗 10 min×3次后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶10 000，Santa Cruz)室溫孵育1 h后加入 ECL(Pierce)發(fā)光底物顯色。用Quantity One凝膠圖像分析軟件對圖像進行分析，根據(jù)目的蛋白灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值的比值得到各目標蛋白相對含量。

1.6 統(tǒng)計學分析

研究數(shù)據(jù)以Excel軟件建立數(shù)據(jù)庫，采用SPSS 16.0進行統(tǒng)計分析。所有資料用±s描述，對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗后，正態(tài)分布資料兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組兔體表心電圖P波平均時限以及P波離散度的比較

成年組P波平均時限為(33.2±5.1)ms，老年組P波平均時限為(46.9±7.6)ms，較成年組延長，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。成年組P波離散度為(8.2±1.8)ms，老年組P波離散度為(15.1±2.7)ms，較成年組P波離散度增大，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)?？ㄍ衅绽深A組與老年組相比，P波平均時限以及P波離散度均縮短分別為(39.7±6.8)ms和(11.8±2.1)ms，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.2 各組兔心房組織AngⅡ含量的比較

實驗8周后測得成年組心房組織AngⅡ含量明顯低于老年組(P＜0.01);卡托普利干預組與老年組相比，心房組織AngⅡ含量明顯降低(見圖1)。

圖1 各組兔心房組織AngⅡ含量比較Figure 1 Comparison of atrial AngⅡlevel among three groups

2.3 各組兔L型鈣離子通道α1C亞基基因和蛋白表達的比較

2.3.1 L型鈣離子通道α1C亞基基因表達比較老年組L型鈣通道α1C亞單位基因表達為1.01±0.35，低于成年組的2.32±0.24(P＜0.01);老年干預組較老年組L型鈣通道α1C亞單位基因表達明顯上調(diào)(1.86±0.49，P ＜0.05，見圖2)。

2.3.2 L型鈣離子通道α1C亞基蛋白表達比較老年組L型鈣通道α1C亞單位蛋白表達明顯低于成年組(0.43±0.12 vs 0.96±0.22，P＜0.01);而卡托普利干預后(0.69±0.16)蛋白表達較老年組明顯增加(P＜0.05，見圖3)。

圖2 三組L-Ca α1C mRNA的相對表達量比較Figure 2 Relative expression of L-Ca α1C mRNA in three groups

圖3 三組L-Ca α1C蛋白表達量比較Figure 3 The expression levels of L-Ca α1C protein in three groups

3 討論

本研究結果顯示，隨著年齡的增加，Pa延長，Pd增大，心房組織AngⅡ的含量增加，L型鈣通道α1C亞單位蛋白以及基因表達均呈現(xiàn)增齡性的減少，這些改變可能為增齡性房顫的發(fā)生提供基質(zhì)。服用卡托普利干預后，Pa、Pd縮短，心房組織AngⅡ的含量降低，而L型鈣通道α1C亞單位表達均增加。說明卡托普利可以抑制RAS激活，可能在一定程度上逆轉(zhuǎn)心房組織電重構，預防增齡性房顫的發(fā)生。

Pa延長標志著心房內(nèi)傳導紊亂，與房顫發(fā)生率有很好的相關性。而Pd則是心房非均質(zhì)電活動的離散程度的反映，Pd增大是房顫發(fā)生的預測因子［5］。本研究發(fā)現(xiàn)與成年組比較，老年組Pa明顯延長，Pd明顯增大，這一結果說明Pa和Pd都呈現(xiàn)一種增齡性的變化，提示增齡可以導致心房傳導速度延長。心房內(nèi)傳導速度的這種增齡變化考慮可能與增齡過程中心房重構逐漸增加進而導致心房除極時間延長及非均質(zhì)性電活動的程度加重有關［6］。

近年的研究發(fā)現(xiàn)，心房電重構在房顫的發(fā)生和維持中起著關鍵的作用。多種離子參與電重構過程，其中最重要的是 L型鈣依賴電流 (ICaL)的變化［7］，它是房顫時動作電位時程(APD)和有效不應期(ERP)改變的主要原因［8］。而離子通道電流變化則是由通道數(shù)目的改變所致。L型鈣通道由α1、α2、β、δ、γ 五種亞單位組成，其中 α1C 亞單位是 L型電壓門控鈣通道蛋白的主要亞單位。van der Velden等［9］在山羊模型上觀察發(fā)現(xiàn)，與竇性心律相比，持續(xù)性房顫心房肌的α1C的mRNA表達顯著降低。張建成等［10］發(fā)現(xiàn)，持續(xù)性房顫患者細胞膜L型鈣通道α1C亞單位mRNA與蛋白的表達均明顯下調(diào)。李妙齡等［11］研究表明，在快速起搏心房6 h后心房L型鈣通道α1C亞單位mRNA表達下調(diào)，其表達含量在隨后起搏過程中仍逐漸下降。以上研究結果說明，L型電壓依賴型鈣通道數(shù)量下調(diào)可能是房顫心房電重構的分子基礎，對房顫的維持和發(fā)展有重要作用。本研究結果顯示老年組心房組織L型鈣通道α1C亞單位的表達下調(diào)，這一改變可能是增齡引起心房電重構的原因之一。Anyukhovsky等［12］在研究健康犬心房顫動的易感性增齡性變化的動物實驗中發(fā)現(xiàn)，老年犬較成年犬動作電位平臺期顯著縮短、動作電位時程顯著延長。既往有研究發(fā)現(xiàn)，老年大鼠心室肌細胞的單相動作電位時程MAPD均較青年大鼠明顯增大。增加刺激頻率后兩組MAPD的縮短程度不同，老年組的縮短明顯大于青年組。推測其機制可能是ICa-L隨著年齡的增長而減小，動作電位相應的代償性地延長，以維持細胞內(nèi)外Ca2+的平衡［13］。

已有大量的研究證實腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的激活在房顫的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。AngⅡ是RAS的主要活性成分，對多種心肌的離子通道具有作用。研究表明，AT1受體能與Kv4.3結合形成復合物，AngⅡ可以促使該復合物向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運，減少該通道在細胞膜的表達量，使Ito減?。?4］。此外，AngⅡ?qū)Ca-L也有調(diào)節(jié)作用，AngⅡ可以抑制ICa-L亮［15］。本研究顯示，老年組 AngⅡ含量較成年組明顯增加，而心房組織L型鈣通道α1C亞單位的表達較成年組明顯減少。此研究結果表明，增齡可以增加心房局部組織AngⅡ含量，可以減少L型鈣通道表達，而這些增齡所致的改變可能為增齡性房顫的發(fā)生提供基礎。RAS阻斷劑ACEI和ARB可以通過阻斷RAS的激活，減少AngⅡ的產(chǎn)生，從而改善心房的電重構和結構重構，預防房顫的發(fā)生。Nakashima等［16］研究了卡托普利和 AT1受體拮抗劑坎地沙坦對心房快速起搏誘發(fā)的電重構的影響，結果顯示卡托普利及坎地沙坦可有效預防快速起搏導致的AERP縮短。Laszlo等［17］在右房快速起搏前1周應用依那普利，結果發(fā)現(xiàn)依那普利可以增加ICa-L亮的電流密度。本研究發(fā)現(xiàn)，老年組給予卡托普利干預后心房組織AngⅡ含量下降，Pa縮短，Pd減小，L型鈣通道α1C亞單位表達增加?？ㄍ衅绽赡芡ㄟ^阻滯RAS激活，降低心房肌AngⅡ含量，逆轉(zhuǎn)增齡所致的L型鈣通道重構，這一研究結果表明阻斷RAS激活可能成為治療增齡性房顫的一個新靶點。

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