沙格雷酯對野百合堿模型大鼠肺動脈高壓的改善作用及對肺動脈NFAT3表達的影響

韓俊麗，田紅燕，遲麗屹，劉 亞，王文平，呂 穎，閆曉麗，張再偉，田 華，范粉靈(西安交通大學醫學院第一附屬醫院心內科，西安 7006;西安交通大學醫學院第二附屬醫院重癥醫學科;解放軍5醫院神經內科;陜西省人民醫院心內科;通訊作者，E-mail:tianhhyy@mail.xjtu.edu.cn)

肺動脈高壓(pulmonary artery hypertension，PAH)死亡率高、預后差。肺動脈重構是肺動脈高壓的主要病理改變之一［1］。肺動脈重構包括中膜、外膜增厚，使遠端小動脈異常肌化，導致管腔狹窄和阻力增高。5-羥色胺(5-HT)既是一種單胺類神經遞質，也是一種重要的血管活性物質，可調節血栓和止血，并作用于內皮細胞和平滑肌細胞，促進細胞增殖［2，3］。5-HT通過 5-HT 受體和 5-HT 轉運體發揮作用。研究表明肺動脈高壓病人和動物模型的血漿中5-HT 水平增高［4，5］，5-HT 受體和 5-HT 轉運體表達增高［6］。抑制5-HT受體可改善模型動物的PAH程度［7］。5-HT 受體家族包括 5-HT1-5-HT7。5-HT2受體家族有 3個亞型，5-HT2A、5-HT2B和 5-HT2C［8］。5-HT2A受體廣泛分布于心血管系統，在平滑肌細胞和血小板中都有分布［9，10］。活化T細胞核因子(nuclearfactorofactivatedT-cells，NFAT)通路控制心血管系統發生過程中的許多步驟，包括心臟瓣膜形成及周圍血管的形成等。NFAT家族有5個亞型，NFATc1-c5［11］。PAH 時 NFATc2 及 NFATc3表達增高，活化后與核內促增殖和抑制凋亡的基因序列結合，促進肺血管重構［12］。

傳統的5-HT2A受體拮抗劑可抑制肺動脈平滑肌細胞增殖和肺動脈收縮，但對肺動脈高壓的改善作用有限［6］。沙格雷酯是一種新型的5-HT2A受體拮抗劑，用于缺血性疾病的治療［10］，如動脈硬化閉塞。本研究采用野百合堿誘導的PAH大鼠模型，觀察了沙格雷酯對PAH的改善作用，以及對肺動脈NFAT3表達的影響，以期為尋找PAH新治療靶點提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

18只SD雄性大鼠150-200 g，購自西安交通大學醫學院實驗動物中心。

1.2 主要實驗儀器設備

高速低溫離心機，凝膠成像分析系統ChemiDocTM(Bio Rad公司)，BL-420E生物信號采集系統(成都泰盟公司)，HX-200動物呼吸機(成都泰盟公司)，正置顯微鏡(Olympus公司)。

1.3 主要試劑

野百合堿(monocrotaline，MCT，Sigma 公司)，沙格雷酯(sarpogrelate，三菱株式會社)，NFAT3兔抗小鼠多克隆抗體(Anbo公司，B0521)，GAPDH兔抗大鼠單克隆抗體(Epitomics公司，2251-1)，二抗為HRP標記的羊抗兔多克隆抗體(Abcam公司，ab6721)

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗動物分組 分為對照組(control組)、野百合堿誘導的肺動脈高壓模型組(MCT組)和沙格雷酯干預組(sarpogrelate組)，每組6只。干預方法如下:①對照組第1天腹腔注射生理鹽水，自腹腔注射生理鹽水第2天開始每天生理鹽水灌胃;②MCT組第1天腹腔單次注射野百合堿(MCT，50 mg/kg)建立PAH模型［13］，自腹腔注射野百合堿第2天開始每天生理鹽水灌胃;③Sarpogrelate組第1天腹腔注射野百合堿，自腹腔注射野百合堿第2天開始每天沙格雷酯灌胃(100 mg/kg)。三組干預4周后進行肺動脈壓力測定和取材。

1.4.2 肺動脈壓力測定 大鼠以10%水合氯醛常規腹腔麻醉后，仰臥位，固定四肢和門齒。切開氣管，置入氣管插管，固定牢固，連接小動物呼吸機(潮氣量 4-6 ml，呼吸頻率 60次/min，吸呼比4∶5)?？v行剪開胸部皮膚，將胸前肌肉掀至一側。沿第3、4肋間隙分開肋間肌，將上下兩側肋骨拉開，暴露出肺動脈。取留置針穿入肺動脈，拔出針芯，留置針另一端接張力換能器，將信號輸送至BL-420E生物信號采集系統。計算平均肺動脈壓力。

1.4.3 取材及染色 壓力記錄完畢后，取出心肺組織。剝離肺動脈并留取肺組織，液氮凍存。分離右室、左室+間隔，分別稱重。以右室重/(左室重+間隔)計算右心指數。肺組織切取外周部分做常規HE染色。以2×肺動脈壁厚/肺動脈外徑評價肺動脈重構程度。

1.4.4 Western blot 取約50 mg肺動脈組織，SDS裂解液冰上裂解。離心后測蛋白濃度。將蛋白原液立即-80℃保存，或變性后進行下一步Western blot實驗。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉印至硝酸纖維素膜。將硝酸纖維素膜以5%脫脂奶粉室溫慢搖封閉1 h。加一抗(NFAT3兔抗小鼠多克隆抗體，1∶500)孵育過夜。TBST洗后加二抗(HRP標記的羊抗兔多克隆抗體，1∶5 000)室溫慢搖孵育1 h。TBST洗后，將化學發光液A液和B液等體積混合，覆蓋于硝酸纖維素膜上反應3-5 min。放入凝膠成像系統成像。Quantity One軟件進行圖像分析。

1.5 結果統計與分析

2 結果

2.1 沙格雷酯對平均肺動脈壓力的影響

沙格雷酯對肺動脈測壓波形的影響見圖1。與對照組相比，野百合堿模型組的平均肺動脈壓力升高(見圖2);沙格雷酯干預組的平均肺動脈壓力較野百合堿模型組降低，但仍比對照組高;均有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 沙格雷酯對右心指數的影響

以右室重/(左室重+間隔)表示右心指數，簡寫為RV/(LV+S)，可反映右室重構程度和肺動脈高壓的嚴重程度。野百合堿模型組的右心指數較對照組增高，沙格雷酯干預組的右心指數較野百合堿模型組降低，但仍高于對照組，差異有統計學意義(P ＜0.05，見圖3)。

2.3 沙格雷酯對肺動脈重構的影響

圖1 沙格雷酯對肺動脈壓力的影響Figure 1 Effect of sarpogrelate on pulmonary artery pressure wave

圖2 沙格雷酯對平均肺動脈壓力的影響 (n=6)Figure 2 Effect of sarpogrelate on mean pulmonary artery pressure (n=6)

圖3 沙格雷酯對右心指數的影響 (n=6)Figure 3 Effect of sarpogrelate on right heart ratio (n=6)

肺組織HE染色顯示，與對照組相比野百合堿模型組的肺動脈壁明顯增厚，沙格雷酯干預后肺動脈壁增厚程度與野百合堿模型組相比明顯減輕(圖4A，B，C，見第750頁)。以2×肺動脈壁厚/肺動脈外徑評價肺動脈重構程度，進行定量分析，簡寫為2×壁厚/外徑，統計結果顯示有同樣的改變趨勢，沙格雷酯干預后肺動脈壁增厚程度較野百合堿模型組降低，但仍較對照組增高(P＜0.05，圖4D，見第750頁)。

2.4 沙格雷酯對肺動脈NFAT3蛋白表達的影響

與對照組相比，野百合堿模型組肺動脈NFAT3蛋白表達增高，沙格雷酯干預后NFAT3蛋白表達較野百合堿模型組降低，差異有統計學意義(P＜0.05，見圖5)。根據抗體說明書 NFAT3也即為NFATc4。

圖4 沙格雷酯對肺動脈重構的影響 (HE染色，×20)Figure 4 Effect of sarpogrelate on pulmonary artery remodeling (HE，×20)

圖5 沙格雷酯對肺動脈NFAT3蛋白表達的影響Figure 5 Effect of sarpogrelate on NFAT3 protein expression in pulmonary artery

3 討論

5-HT是一種重要的神經遞質和血管活性物質。循環中的5-HT主要儲存于血小板中。損傷、缺血等因素可刺激血小板釋放5-HT，作用于內皮細胞和平滑肌細胞［2，3］，內皮細胞也可產生 5-HT［6］。5-HT作為一種血管活性物質，在心血管系統中可引起血管收縮、細胞增殖、血小板聚集等［12］。5-HT通過5-HT受體和 5-HT轉運體發揮作用［8，14］。5-HT及受體和轉運體在PAH過程中起重要作用。研究表明PAH病人和PAH模型動物的血漿中5-HT水平增高［4，5］，5-HT 受體和 5-HT 轉運體表達增高［6］。因此5-HT受體和5-HT轉運體是PAH的治療靶點，受到越來越多的研究關注。

5-HT受體分為7類，分別是5-HT1-5-HT7。5-HT2受體家族有3個亞型，分別為5-HT2A、5-HT2B和5-HT2C［8］。5-HT2A受體不僅參與中樞神經系統和外周神經系統的病理生理過程，而且在心血管系統中廣泛分布，參與心血管系統的病理生理過程［9，10］。5-HT2A受體在血管平滑肌細胞收縮、細胞增殖和遷移、血小板聚集、血栓形成和冠脈痙攣等過程中發揮作用［10］。本研究表明5-HT2A受體拮抗劑沙格雷酯可降低野百合堿誘導的PAH模型的肺動脈壓力，減輕肺動脈壁增厚程度和右心指數。以往研究表明抑制5-HT受體可減輕肺動脈高壓程度。Porvasnik等對一種新的5-HT2B受體拮抗劑PRX-08066的研究表明，在MCT誘導的PAH模型中，PRX-08066可降低肺動脈壓力、右室重和右室肥厚，減輕肺動脈重構，增加右室射血分數，并且可升高左室舒張容積、收縮容積、射血容積［15］。Morecroft等研究表明5-HT1B受體拮抗劑LY393558可降低PAH模型的右室壓力、右心指數和肺動脈重構，抑制5-HT引起的肺動脈收縮，抑制5-HT對來源于肺動脈高壓病人的肺動脈平滑肌細胞的促增殖作用［16］。Dumitrascu等研究發現5-HT2A/B受體拮抗劑Terguride可減輕野百合堿誘發的大鼠肺動脈壓力增高，并且Terguride可抑制肺動脈平滑肌細胞的增殖和遷移［17］。傳統的5-HT2A受體拮抗劑如ketanserin改善PAH的作用有限［6］。沙格雷酯是一種新型的5-HT2A受體拮抗劑，用于缺血疾病的治療，如用于慢性動脈硬化閉塞導致的疼痛、潰瘍等缺血癥狀的治療［10］。目前缺乏沙格雷酯用于肺動脈高壓治療的研究。Kato等研究表明對系統性硬化癥伴有呼吸衰竭和右心衰竭的病人使用沙格雷酯后，可降低平均肺動脈壓力，增加右室射血分數［18］。Hironaka等研究發現對野百合堿誘導的PAH模型大鼠使用沙格雷酯，可抑制肺高壓的發展，增加生存率;肺組織的免疫組化結果表明沙格雷酯有抗炎、抗增殖作用;Western blot結果提示沙格雷酯可增加肺組織NO合酶的蛋白表達水平，表明沙格雷酯可能會改善內皮功能［19］。閆曉麗等研究結果表明沙格雷酯對肺動脈高壓模型動物有改善作用，與本研究結果一致［20］。沙格雷酯的結構與ketanserin和其他5-HT2受體拮抗劑不同，可能因為這種化學結構的不同導致作用的差異［10］。在心血管系統中，沙格雷酯可抑制血管收縮、心肌肥厚和細胞增殖。Gong等研究表明沙格雷酯可抑制5-HT引起的冠狀動脈收縮［21］，Ikeda等研究表明沙格雷酯有抑制心肌肥厚的作用［22］，Sharma等的研究表明沙格雷酯可抑制主動脈平滑肌細胞增殖［23］。

本研究還觀察了沙格雷酯對肺動脈組織NFAT3表達的影響。結果表明野百合堿誘導PAH模型大鼠的肺動脈組織NFAT3蛋白表達增高，沙格雷酯可減低NFAT3蛋白表達。NFAT家族有5個亞型，NFATc1-c5。NFAT家族的共同特征包括N末端的NFAT同源結構域(NHR)和C末端的Rel同源結構域。NHR與調節功能有關，包括鈣調神經蛋白的結合位點、核定位和核輸出、一些絲氨酸/蘇氨酸激酶磷酸化位點。Rel同源結構域介導 DNA結合［11］。本研究觀察的 NFAT3即為 NFATc4亞型。有觀點認為NFATc3是平滑肌細胞中的主要亞型，主要位于胞質中，也有認為培養的人肺動脈平滑肌細胞上表達NFATc4，還有認為大鼠主動脈平滑肌細胞主要表達NFATc1和NFATc2［24］。鈣調神經磷酸酶(calcineurin)活化后，促進NFAT發生磷酸化，使NFAT轉位至核內。在核內，NFAT與DNA序列結合，促進轉錄和細胞增殖［25］。PAH時存在NFAT表達和活性異常。Bonnet等的研究認為正常人和繼發性肺動脈高壓病人的肺小動脈低表達NFATc2。然而肺動脈高壓病人的肺動脈高表達NFATc2。特發性肺動脈高壓病人的肺動脈平滑肌細胞中，60%以上的細胞顯示NFATc2活化，約20%顯示NFATc3活化［12］。本研究結果顯示 MCT誘導PAH模型大鼠肺動脈的NFAT3表達增高，與以往研究是類似的。NFAT是PAH發生機制中多種信號通路的共同的環節。NFAT抑制劑VIVIT可降低細胞內鈣。特發性肺動脈高壓病人的肺動脈平滑肌細胞存在線粒體超極化，可被 NFAT抑制劑 VIVIT逆轉，并且VIVIT可以增加肺動脈平滑肌細胞凋亡、減少增殖［12］。因此抑制NFAT可能成為PAH治療的新靶點。本研究中使用5-HT2A受體拮抗劑沙格雷酯，可下調PAH模型動物肺動脈組織的NFAT3蛋白表達，表明5-HT2A受體可能參與了PAH時NFAT3上調的過程?？赡艿慕忉尀?，5-HT2A受體被激活后，導致細胞內鈣離子升高［10］，促使NFAT活化，轉位至核內，與促進增殖和抑制凋亡的基因序列結合，引起細胞增殖［12，25］，最終導致肺動脈重構。

綜上所述，本研究表明5-HT2A受體拮抗劑沙格雷酯可改善野百合堿誘導PAH模型大鼠肺動脈高壓的程度，包括減低肺動脈壓力、減輕肺動脈重構和右心指數。PAH模型動物的肺動脈NFAT3蛋白表達增高，沙格雷酯可下調NFAT3蛋白表達水平，表明5-HT2A受體可能參與了PAH時NFAT3上調的過程。沙格雷酯改善PAH的作用需要更多研究支持，NFAT也有可能成為新的治療PAH的靶點。

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