冠心病患者外周血TL1A表達水平及臨床意義

紀玉強，劉佩勇，謝 梅，趙 朝，程曼麗(西安市第一醫院心內科，西安 710002;通訊作者，E-mail:jiyuqiang112299@126.com)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary heart disease，CHD)簡稱冠心病，是嚴重危害人類健康的常見病。近年來越來越多的實驗和臨床研究發現炎癥反應、T細胞參與了動脈粥樣硬化發生發展的各個階段［1，2］。腫瘤壞死因子配體相關分子 1A(tumor necrosis factor lingand-related molecule-1A，TL1A)是新近發現的腫瘤壞死因子超家族的成員，可以誘導內皮細胞凋亡，抑制腫瘤生長，最近研究表明TL1A還可以活化T細胞，促進Th1細胞分泌干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)，在免疫調節及炎癥反應中發揮重要作用［3-6］。為了進一步研究TL1A在冠心病中的作用，本研究檢測不同類型冠心病患者外周血中TL1A表達水平，初步探討TL1A在冠心病中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2012-03～2012-12在西安市第一醫院心內科住院的冠心病患者90例，根據WHO冠心病的診斷標準分為急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)組25例、不穩定型心絞痛(unstable angina pectoris，UA)組30例、穩定型心絞痛(stable angina pectoris，SA)組35 例。

AMI診斷標準為符合以下3項中的任2項:①持續劇烈胸痛30 min以上;②典型的心電圖動態演變;③心肌損傷標志物肌酸激酶同工酶(CK-MB)或肌鈣蛋白(TnI)等有動態變化。

UA診斷標準:患者入院前48 h內出現過靜息性胸痛，一過性的ST段水平或下斜行壓低≥1 mm伴或不伴有T波倒置，無CK-MB或TnI升高2倍以上，冠狀動脈造影至少有1支血管直徑狹窄＞50%。

SA診斷標準:典型的勞力性心絞痛伴有運動試驗陽性，冠狀動脈造影至少有1支血管直徑狹窄＞50%。

排除標準:6個月內的心肌梗死、發病到抽血時間≥24 h、炎癥性疾病、自身免疫性疾病、心房顫動、心臟瓣膜病、肝腎疾病、惡性腫瘤及血液系統疾病。

35例同期住院的經冠狀動脈造影證實所有血管直徑狹窄＜50%及排除冠狀動脈痙攣的住院患者為對照組。本研究得到我院倫理委員會批準并取得所有受試者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器 人TL1A ELISA檢測試劑盒購自美國R＆D公司，RNA提取液TRIzol購自美國Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒購自立陶宛Fermentas公司，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ購自大連寶生物工程有限公司，PCR引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。熒光定量PCR擴增儀(美國Bio-Rad公司)，DENLEY DRAGON Wellscan MK 3酶標儀(芬蘭Thermo公司)。

1.2.2 實時定量PCR檢測外周血TL1A mRNA的表達水平 所有研究對象在入院時抽取靜脈血3 ml，利用淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，加入1 ml TRIzol液提取細胞總RNA，利用逆轉錄試劑盒進行cDNA第一鏈合成，所有實驗操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。參照Genbank cDNA中的TL1A及內參GAPDH基因序列利用Primer Premier 5.0軟件設計引物，TL1A上游引物5’-TTTGGGGAAACAGCCAGTGT-3’，下游引物5’-GGTGTGCCCTTGGCTTATCT-3’，產物大小271 bp;GAPDH上游引物5’-GACAGTCAGCCGCATCTTCT-3’，下游引物5’-GCGCCCAATACGACCAAATC-3’，產物大小104 bp。20 μl PCR 反應體系:10 μl SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2 ×)、PCR 上、下游引物(10 μmol/L)各2 μl、6 μl DNA 模板。PCR 反應條件:95℃ 30 s預變性，95℃ 5 s、60℃ 30 s 40個循環，反應結束后采用Bio-Rad iQ520分析軟件進行數據分析。

1.2.3 酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血漿中TL1A水平 所有研究對象在入院時抽取靜脈血2 ml，分離血漿-20℃保存待測。采用ELISA試劑盒測定血漿中的TL1A的含量，實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行，每個樣本做3個復孔。

1.3 統計學分析

利用SPSS 16.0進行統計學處理，計數資料比較采用χ2檢驗，計量資料采用±s表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組研究對象臨床資料比較

各組研究對象在年齡、性別、吸煙、高血壓、糖尿病、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇及高密度脂蛋白膽固醇等因素的差異沒有統計學意義(P ＞0.05，見表1)。

2.2 各組研究對象外周血中TL1A mRNA水平的比較

實驗結果發現SA組、UA組、AMI組患者外周血中TL1AmRNA水平明顯高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)，UA組、AMI組患者與SA組患者相比外周血中TL1A mRNA水平升高，差異有統計學意義(P＜0.05，見表2)。

表1 各組研究對象臨床資料的比較Table 1 Clinical characteristics of patients in different groups

表2 各組研究對象外周血中TL1A mRNA和血漿TLIA水平的比較(±s)Table 2 Comparison of the levels of TL1A mRNA in the peripheral plasma TL1A levels blood among different groups(±s)

表2 各組研究對象外周血中TL1A mRNA和血漿TLIA水平的比較(±s)Table 2 Comparison of the levels of TL1A mRNA in the peripheral plasma TL1A levels blood among different groups(±s)

與對照組相比，*P＜0.05，與SA組相比，△P＜0.05

組別 n TL1A mRNA TL1A/(ng/ml)對照組35 0.28±0.09 0.82±0.21 SA組 35 0.35±0.10* 0.98±0.22*UA組 30 0.43±0.11＊△ 1.22±0.24＊△AMI組 25 0.53±0.13＊△ 1.41±0.29＊△

2.3 各組研究對象血漿中TL1A水平的比較

實驗結果發現SA組、UA組、AMI組患者血漿中TL1A水平明顯高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)，UA組、AMI組患者與SA組患者相比血漿中TL1A水平升高，差異有統計學意義(P＜0.05，見表2)。

3 討論

冠心病主要由動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)引起，AS發生發展的機制尚未完全清楚，目前認為AS是一種慢性炎癥性疾病，多種炎性細胞因子和免疫細胞尤其是巨噬細胞和T淋巴細胞參與了AS的發生發展過程，我們前期研究證實Th1/Th2細胞失衡以及Th17細胞均在粥樣斑塊的形成及斑塊的不穩定性中起重要作用［7-9］。

TL1A是新近發現的屬于腫瘤壞死因子超家族成員15的新型細胞因子，其基因定位于染色體9q32，由4個外顯子組成，編碼含有251個氨基酸的蛋白質。TL1A在內皮細胞尤其在人臍靜脈內皮細胞中高表達，T細胞、B細胞、NK細胞、單核細胞及樹突狀細胞也少量表達，激活狀態下表達顯著增多。TL1A不僅可以誘導內皮細胞凋亡，抑制腫瘤生長，而且研究表明TL1A可以與死亡受體3結合，為T淋巴細胞活化提供第二刺激信號，可以促進巨噬細胞和中性粒細胞趨化至炎性部位，同時TL1A具有獨特的Th1細胞極化作用，促進白細胞介素2(interleukin 2，IL-2)、IFN-γ 等炎性因子的釋放［4-6］。此外TL1A能夠增強Th17細胞的增殖和分化，促進其釋放前炎癥因子IL-17［10-13］。國外學者研究發現TL1A在人頸動脈粥樣斑塊中高表達，TL1A可以誘導細胞高表達促炎性因子和趨化因子，產生細胞外基質金屬蛋白酶，促進細胞外基質降解，從而降低斑塊的穩定性［14-17］。我們實驗結果發現不同類型的冠心病患者外周血中TL1A mRNA水平及血漿TL1A水平明顯高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)，AMI、UA組患者與SA組患者相比外周血中TL1A mRNA水平及血漿TL1A水平升高，差異有統計學意義(P＞0.05)。綜合目前關于冠心病及TL1A的研究結果，我們推測冠心病患者體內TL1A水平升高，可能促進巨噬細胞和中性粒細胞趨化，活化T淋巴細胞，分泌炎性細胞因子，促進動脈粥樣硬化斑塊的形成。同時AMI及UA患者體內TL1A水平明顯升高，在促進炎癥因子釋放的同時，可能促進了Th1及Th17細胞極化，產生細胞外基質金屬蛋白酶，降低斑塊的穩定性，導致AMI及UA的發生。

綜上所述，冠心病患者外周血中TL1A水平增高，可能通過炎性反應和Th1及Th17細胞極化，參與了粥樣斑塊的形成，導致斑塊的不穩定性，但TL1A水平增高及具體作用機制尚待進一步研究，這對預防和治療冠心病尤其是急性冠脈綜合征具有一定的指導意義。

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