廣西地區乙肝病毒基因分型與臨床表現及機體免疫功能關系的研究

鐘大妮等

【摘要】 目的：研究廣西地區乙肝病毒基因型分布及與臨床表現及機體免疫功能的關系。方法：收集廣西地區原籍人口不同病情的慢性乙肝病毒相關性疾病包括無癥狀攜帶者（ASC）、慢性乙型病毒性肝炎（CHB）、乙肝后肝硬化（LC）、原發性肝癌（HCC）血液標本，檢測乙肝病毒血清學標志物（HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc和抗-HBcIgM），HBVDNA拷貝數，肝功能，T淋巴細胞亞群，型特異性引物巢式PCR及測序鑒定病毒基因型，利用統計軟件SPSS 17.0進行資料分析。結果：本研究檢測納入的研究對象感染乙肝病毒為B、C兩種基因型，未檢測到其他基因型，以C型（66.3%）為主，B型（33.7%）次之。C基因型的HBeAg血清轉換率低于B型（P<0.05）。C型在肝癌組的比例顯著高于其他疾病組（P<0.05），不同基因型間年齡、HBVDNA拷貝數、AST、ALT、T細胞亞群CD3（+）、CD4（+）、CD8（+）的差異無統計學意義。結論：廣西地區乙肝病毒感染相關性肝病患者HBV基因型為B型、C型，以C型為主，C型與較嚴重病情有關，感染不同HBV基因型與機體的免疫狀況無明顯相關。

【關鍵詞】 乙肝病毒； 基因型； 臨床表現； T淋巴細胞亞群

乙型病毒性肝炎是危害嚴重的慢性傳染性疾病，迄今全世界至少有3.5億人感染乙肝病毒（HBV）[1]。廣西是乙肝病毒的高流行區，人群中乙肝病毒的攜帶率基數大，乙型肝炎發病率約為60.5/10萬[2]。慢性HBV感染致肝細胞炎癥損傷，遷延反復，導致肝細胞壞死及纖維結締組織增生，發展為肝硬化、肝細胞癌，嚴重威脅人類生命健康[3]。近年研究發現乙肝病毒可根據全基因序列差異>8%或S基因片段差異>4%分為A-H共8個基因型，在我國主要是B型和C型[4]；HBV傳播方式、臨床表現、疾病轉歸、抗病毒治療效果與病毒的基因分型都有一定的相關性[5]。為了解廣西地區乙肝病毒基因分型和致病性差異，病毒基因型和不同嚴重程度慢乙肝機體免疫功能的差異的關系，本研究收集了廣西原籍人口無癥狀乙肝病毒攜帶者（ASC），輕、中、重慢乙肝患者（CHB），乙肝肝硬化（LC）以及肝癌（HCC）患者血清標本，進行不同疾病譜的HBV基因型分析及比較感染不同基因型的機體T淋巴細胞亞群情況。

1 材料與方法

1.1 材料 乙肝病毒標記物試劑盒（艾康生物技術（杭州）有限公司）；高速冷凍離心機（Eppenndorf Centeifuge，德國）；PCR擴增儀（PTC-220MJ Reaearch， USA）；DYY-2型穩壓穩流電泳儀（北京六一儀器廠）；紫外分析儀（UV-1700（E）230CE，日本島津公司）；FACSCalibur流式細胞儀（美國Becton-Kickin-son公司）；血清病毒DNA提取試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；PCR Mix緩沖液及超純水（大連寶生物有限公司）；東勝Marker（上海東勝生物公司）；瓊脂糖（日本TaKaRa公司）；FACSCount Reagent Kit（美國BD公司）引物設計參照文獻[6]報道，分別為兩條外引物P1、P1R；公用上游引物P2，A、B、C三型特異下游引物；公用下游引物P3R，D、E、F三型特異上游引物，共10條引物，由生工生物（上海）有限公司生產。血液樣本來源于2008-2011年廣西醫科大學第一附屬醫院傳染科門診及住院部、肝膽外科住院部，廣西醫科大學腫瘤醫院住院部患者，診斷符合2005年修訂《慢性乙型肝炎防治指南》[7]，入選患者排除甲肝、丙肝、戊肝、HIV、酒精性肝病、自身免疫性肝炎等疾病。

1.2 方法

1.2.1 HBV marker（HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb）檢測 嚴格按照酶聯免疫吸附法試劑盒操作。對乙肝病毒表面抗原（HBsAg）陽性者，送廣西醫科大學第一附屬醫院做熒光定量PCR檢測HBVDNA拷貝數。

1.2.2 血清病毒基因型檢測 血清病毒DNA提取按照試劑盒說明書。取2 μl乙肝病毒DNA提取液，巢式PCR方法參照文獻，條件稍作改動[6]。在0.5 ml離心管中加入上下游外引物（50 pmol/L）各1 μl，25 μl PCR Mix，2 μl病毒DNA提取液，加21 μl超純水至50 μl，輕微震蕩混勻后，進行第1輪PCR擴增。取2 μl每一個樣本的第一輪PCR產物加上A、B、C引物和對應的公用引物（50 pmol/L）各1 μl，PCR Mix、超純水按照第一輪加入。在另一離心管D、E、F基因型的檢測同前所述。將兩組巢式PCR產物進行凝膠電泳，參照Marker得到產物的相對分子質量判斷基因型，A型為68 bp，B型為281 bp，C型為122 bp，D型為119 bp，E型為167 bp，F型為97 bp。對不能用巢式PCR成功分型的樣本送生工生物工程（上海）有限公司測序。并隨機選擇10個成功分型的樣本測序以鑒別本實驗分型的可靠性。

1.2.3 T淋巴細胞亞群檢測 對慢乙肝組患者進行流式細胞儀檢測T淋巴細胞亞群CD3、CD4、CD8：每個12×75 mm樣品測定管加入50 μl抗凝血（EDTA-K2抗凝），各管加入10 μl三色單抗，輕微振蕩混勻，室溫避光放置20 min；加1 ml溶血素裂解紅細胞，輕微振蕩，避光10 min，接著離心棄上清2次，加PBS后上機檢測。取50 μl全血加10 μl IgG1-FITC/IgG1-PE/IgGl-PE-Cy5（小鼠），作為陰性對照，其他步驟同上。每份標本測定5000個細胞，全部數據用流式細胞儀和軟件SYSTEM II獲取和分析。

1.3 統計學處理 HBVDNA先進行對數轉換后再進行比較。統計學分析采用SPSS 17.0軟件，計量資料以（x±s）表示，均數的比較采用t檢驗或F分析，率的比較采用 字2檢驗，雙側P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究病例納入情況 共收集病例ASC46例，CHB103例，LC58例，HCC46，所有病例乙肝表面抗原（HBsAg）均為陽性，排除病毒DNA拷貝數<1×103后，得到最后研究病例ASC 31例，CHB 85例（輕度17例，中度36例，重度32例），LC 30例，HCC 35例。男性144例，女性37例，年齡13～84歲。每個病例組的平均年齡、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、乙肝病毒DNA拷貝數及乙肝病毒e抗原（HBeAg）的情況見表1。

2.2 HBV基因分型 將PCR產物在1.5%濃度瓊脂糖凝膠電泳，基因分型為B型或C型，未檢測到B、C混合型，未發現其他基因型。將測序結果與NCBIGene數據庫病毒序列比對得到測序的基因分型為B型或C型。所有病例中B型61例（33.7%），C型120例（66.3%），發病者主要集中在大于30歲的人群，C基因型的>30歲患者比重較大。各疾病譜基因分型及對應的指標值見表2。

2.3 各疾病譜基因型分布 HCC組 C型的比例（91.4%）均高于ASC（67.7%）、CHB（56.5%）、LC（63.3%），差異均有統計學意義（P<0.05）。ASC組、CHB組、LC組組內的C型比例較B型高，但組間分布差異無統計學意義。

2.4 乙肝病毒e抗原與基因型 B型組HBeAg（+）為36.1%，低于C型組的HBeAg（+）的60%，差異有統計學意義（P=0.002）。

2.5 乙肝病毒基因型與病毒DNA拷貝數 B型HBVDNA平均拷貝數為2.21×107，C型的為1.31×107，兩者比較差異無統計學意義（P=0.333）。

2.6 乙肝病毒基因型與ALT、AST的關系 B基因型組與C基因型組ALT、AST差異均無統計學意義（PALT=0.486，PAST=0.673）。ASC、CHB、LC、HCC組內比較也發現ALT、AST與基因型無關。

3 討論

據文獻報道，我國流行的HBV基因型主要為B型和C型，但各地區基因型分布情況不盡相同。本研究發現，廣西地區原籍人口中感染的HBV基因型主要為C型，其次為B型。據文獻報道，北京、黑龍江及廣東、河南、山西等多地區的主要流行基因型也是C型[8-11]，提示我國的主導基因型為C型，廣西HBV基因型分布與全國一致。

本研究結果表明，廣西地區原籍人口C基因型的乙肝病毒相關性肝病的發病主要是在25歲之后，這與Yin等[12]先前在國內做的社區調查的報道相似。廣西是HCC高發區之一，本研究顯示，HCC組C基因型的比例均明顯高于ASC、CHB、LC組，表明C基因型與肝癌的進展密切相關[13]。對30歲以上的乙肝病毒攜帶者檢測病毒基因分型有助于預測肝癌發病風險[14]。有研究報道，C基因型引起的肝臟疾病臨床表現的嚴重程度較B型高，包括較高的肝癌術后復發率、延遲的血清轉換、較高的DNA拷貝數、較高的ALT水平[14-15]；也有研究報道B基因型引起的臨床表現較為嚴重[12，16]；Zeng等[17]報道B、C基因型的肝病嚴重程度包括肝功能、肝臟炎癥、纖維化差異并無統計學意義。本研究中廣西地區原籍人口C型HBeAg血清轉換率顯著低于B型的，提示HBV C基因型感染患者病毒的復制與感染性較B基因型高，但兩種HBV基因型的ALT、AST及HBVDNA水平無顯性差別。報道的不一致可能與地區分布的乙肝病毒流行特點、病毒亞型及患者的環境因素、生活習慣有關[18]。

一般認為，HBV致肝臟損害主要由機體對HBV免疫應答介導，肝細胞感染HBV后在細胞表面表達的病毒可引起細胞毒性T細胞反應，多種因素可影響這種免疫應答的強度，其中包括病毒遺傳物質多態性[19-20]。為了解HBV基因型是否與機體T細胞免疫有關，本研究比較了慢性HBV感染相關性肝病患者B、C基因型外周血的T細胞亞群CD3（+）、CD4（+）、CD8（+）的數量，結果表明，C基因型的CD3（+）、CD4（+）、CD8（+）T細胞與B型均無顯著性差別，此結果可能與研究樣本相對較小有關。綜上所述，廣西地區流行的HBV以B型、和C型為主，未見其他基因型，或B、C重疊情況。C基因型與較嚴重的HBV感染相關性肝病病情有關，HBV基因型與機體細胞免疫狀態的關系仍需進一步加大樣本量進行研究。

參考文獻

[1] Lavanchy D.Hepatitis B virus epidemiology，disease burden，treatment， and current and emerging prevention and control measures[J].J Viral Hepat，2004，11（2）：97-107.

[2] 沈立萍，楊進業，莫兆軍，等.廣西壯族自治區1996-2005年乙型肝炎發病狀況監測分析[J].疾病控制雜志，2007，10（2）：210-211.

[3] Weber A，Boege Y，Reisinger F，et al.Chronic liver inflammation and hepatocellular carcinoma： persistence matters[J].Swiss Med Wkly，2011，141（4）：13197.

[4] Schaefer S.Hepatitis B virus：significance of genotypes[J].J Viral Hepat，2005，12（4）：111-124.

[5] 楊艷杰，成軍，陳東風，等.乙型肝炎病毒基因分型的臨床意義[J].世界華人消化雜志，2004，12（7）：1670-1673.

[6] Naito H，Hayashi S，Abe K.Rapid and specific genotyping system for hepatitis B virus corresponding to six major genotypes by PCR using type-specific primers[J].J Clin Microbiol，2001，39（25）：362-364.

[7] 中華醫學會肝病學分會，中華醫學會感染病學分會.慢性乙肝防治指南（續一）[J].醫藥導報，2006，5（13）：493-497.

[8] 王繼榮，周莉，趙洪斌，等.北京地區乙肝病毒s基因序列多態性及其分布[J].世界華人消化雜志，2007，15（23）：2496-2502.

[9] 許軍，王齊欣，范春蕾，等.中國南北兩城市乙型肝炎病毒基因型與血清型的構成差異[J].中華實驗和臨床病毒學雜志，2003，4（17）：327-329.

[10] 王福青，黃小蕾，李愛琴，等.河南省不同地區、不同肝病患者的hbv基因型分布[J].山東醫藥，2008，38（9）：81-82.

[11] 郭瑜，劉曉燕，胡惠梅，等.山西省乙型肝炎病毒基因型別的初步研究[J].中華實驗和臨床病毒學雜志，2006，7（6）：361-363.

[12] Yin J，Zhang H，He Y，et al.Distribution and hepatocellular carcinoma-related viral properties of hepatitis B virus genotypes in Mainland China： a community-based study[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2010，19（28）：777-786.

[13] Ding X，Mizokami M，Yao G，et al.Hepatitis B virus genotype distribution among chronic hepatitis B virus carriers in Shanghai， China[J].Intervirology，2001，44（15）：43-47.

[14] Yu M W，Yeh S H，Chen P J，et al.Hepatitis B virus genotype and DNA level and hepatocellular carcinoma： a prospective study in men[J].J Natl Cancer Inst，2005，97（9）：265-272.

[15] Sumi H，Yokosuka O，Seki N，et al.Influence of hepatitis B virus genotypes on the progression of chronic type B liver disease[J].Hepatology，2003，37（6）：19-26.

[16] 胡譚，劉映霞.湖南省乙肝病毒基因型分布及臨床意義[J].湖南醫科大學學報，2002，40（1）：29-31.

[17] Zeng G，Wang Z，Wen S，et al.Geographic distribution， virologic and clinical characteristics of hepatitis B virus genotypes in China[J].J Viral Hepat，2005，12（95）：609-617.

[18] Li Y J，Zhuang H，Li J，et al.Distribution and clinical significance of hepatitis B virus（HBV） genotypes and subtypes in HBV-infected patients[J].Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi，2005，13（6）：724-729.

[19] Lau J Y，Wright T L.Molecular virology and pathogenesis of hepatitis B[J].Lancet，1993，342（45）：1335-1340.

[20] Rehermann B，Fowler P，Sidney J，et al.The cytotoxic T lymphocyte response to multiple hepatitis B virus polymerase epitopes during and after acute viral hepatitis[J].J Exp Med，1995，181（13）：1047-1058.

（收稿日期：2012-11-23） （本文編輯：陳丹云）