BRAF基因與甲狀腺癌分子診療的研究進展

陳思睿　曹仁賢

【摘要】 對甲狀腺結節進行細針穿刺細胞學檢查，給臨床醫生診斷甲狀腺腫瘤提供了一個新的信息。該技術在甲狀腺癌的臨床診斷中，特別是BRAF基因的應用，在一定程度上提高了甲狀腺癌診療水平。國內外最新研究表明，BRAF基因檢測為甲狀腺癌的診斷和預后提供了參考，并給臨床上甲狀腺癌的初始化治療指明了一個方向。對于臨床細針穿刺細胞學檢測不能確定的甲狀腺癌，BRAF分子檢測技術可作為一個有用的檢測手段，為臨床診斷甲狀腺癌提供一個決定性的參考，使更多的甲狀腺癌患者得到個體化的治療。本文就BRAF基因與甲狀腺癌分子診療的關系進行綜述。

【關鍵詞】 BRAF； 細胞學； 分子診斷； 甲狀腺癌

甲狀腺癌是最常見的內分泌惡性腫瘤，甲狀腺癌來自濾泡或者濾泡旁細胞。濾泡源性腫瘤最普遍存在于甲狀腺癌中，包括乳頭狀癌、卵泡癌和嗜酸性細胞癌。這些分化型甲狀腺癌占所有甲狀腺惡性腫瘤的95%[1]。過去幾十年里整個西方世界甲狀腺癌的發病率在增加。我國甲狀腺癌的發病率由10/100萬升到約30/100萬～40/100萬；而美國則增長了300%，乳頭狀癌大概占所有甲狀腺癌的80%～90%[2]。臨床上診斷甲狀腺癌的方法非常多，如細針穿刺細胞學檢查、PET/CT、DNA測序熒光原位雜交、PCR、逆轉錄PCR、實時PCR以及單鏈構象多態性分析PCR等，在一定程度上都能對甲狀腺癌的診斷提供幫助，但在準確率上存在一定的假陰性。最近的研究表明，對甲狀腺結節進行BRAF基因的檢測對于排除或診斷甲狀腺癌具有重要的臨床意義。由此可見，BRAF基因的檢測在甲狀腺癌的臨床診斷中扮演著至關重要的作用。以下就臨床上對甲狀腺癌診斷具有重要作用的檢測方法進行闡述。

1 細針穿刺細胞學檢查在甲狀腺癌診斷中的局限性

1.1 細針穿刺細胞學檢查的局限性 甲狀腺結節為臨床上常見的甲狀腺疾病，但僅有5%的甲狀腺結節發展為惡性腫瘤。術前通過對甲狀腺結節進行細針穿刺細胞學檢測是目前診斷甲狀腺腫瘤的一個較好的診斷方法。是使用細針及針管，刺入病變區域內，通過提插等方式將病灶內的細胞或小組織塊切割下來，同時借助針管內負壓將其吸出，涂片及染色后在光鏡下閱片，最后完成病理診斷的一種活檢方法。其目的主要為診斷是否腫瘤、良惡性及類型，已成為腫瘤確診的主要手段之一，尤其是近10年來影像技術的發展，在B超引導下，應用細針穿刺對淺表腫塊，如乳腺、甲狀腺、淋巴結等進行細胞學活檢，是早期診斷腫瘤的最快捷、簡便與安全的方法。研究表明，對穿刺出的組織樣本進行分子生物學檢測可明顯提高該疾病細胞學診斷的準確度[3]，但其仍存在一定的局限性，主要包括以下幾個方面：（1）不能從良性配對物中分辨卵泡狀細胞癌還是嗜酸性細胞腺癌；（2）有造成惡性腫瘤轉移和擴散的可能性；（3）穿刺為有創性的檢查，可能會損傷血管或神經等；（4）穿刺不到位，有可能導致陰性結果的出現，從而延誤疾病的診療時機。

1.2 貝塞斯達甲狀腺細胞穿刺分級系統在甲狀腺癌診斷中的作用 為了指出細胞穿刺的診斷局限性，這個分級系統提出了以下幾種分類：不符合要求的、良性、惡性、不確定惡性腫瘤的、非典型和可疑性腫瘤的。這些分類最近已在一個學術機構被前瞻性的測試過[4]。學者們在一年內收集了3207例甲狀腺結節，評估發現這些病例中不符合要求的有11.1%，良性73.8%，惡性5.2%，不確定惡性腫瘤的9.8%：其中包括5.5%濾泡性腫瘤/許萊特細胞腫瘤，3%非典型和1.3%可疑性腫瘤。378例患者接受了外科手術，有2.2%的假陽性率。貝塞斯達系統作為所有腫瘤的篩選方式，其特異性為68%，而作為惡性腫瘤的診斷方式其特異性為93%。還有一些學者發現，不確定惡性腫瘤中的惡性風險：非典組17%，濾泡性腫瘤25.4%，可疑性腫瘤組為70%[5]。這些結果說明，即使沒有對穿刺出的組織進行細胞學檢測，可疑性腫瘤組的惡性風險非常高，需要引起專科醫生的重視[4-5]。關于分子診斷，國家癌癥研究所的建議中明確規定：鑒于目前有限的證據，進一步的研究應適應臨床使用的需要[6]。

2 分子檢測技術在診斷甲狀腺癌中的作用

能檢測各種標本分子突變的生物技術在臨床檢測中被廣泛應用，這些標本不僅限于血液、唾液試紙、新鮮的冰凍組織、細針穿刺組織，還包括福爾馬林固定石蠟包埋的組織。當今臨床實驗室常見的分子分析技術包括DNA測序熒光原位雜交、PCR以及一些改良的分子檢測技術，如逆轉錄PCR、實時PCR、單鏈構象多態性分析PCR。沈樑等[7]對21例甲狀腺癌患者應用亞甲藍染色法行前哨淋巴結活檢（sentinel lymph-node biopsy，SLNB），對SLN進行HE染色、細胞角蛋白19（CK19）的免疫組化染色（IHC）及RT-PCR檢測，比較三種方法對SLN微轉移灶檢出的敏感性、準確率的差異。結果21例中，成功檢出SLN 16例，檢出率為76.2%。IHC、RT-PCR與HE比較差異有統計學意義。表明前哨淋巴結活檢可有效判斷甲狀腺癌轉移狀態，應用RT-PCR檢測CK19在SLN中的表達，可提高敏感度及準確率。

3 BRAF基因的分子結構、生物學功能以及在甲狀腺癌診斷方面的作用

3.1 BRAF基因的分子結構及生物學功能 BRF基因，別名鼠類肉瘤濾過性毒菌（v-raf）致癌同源體B1；1988年由Ikawa等[8]首先在人類尤文氏肉瘤中發現并將其克隆出來，是一個能對NIH3T3細胞進行轉染且具有生物學活性的一種DNA序列；由于其與CRAF基因、ARAF基因的同源性非常的高，故又有學者將其稱為BRAF基因。BRAF基因由783個氨基酸組成，位于染色體7q34的BRAF基因能夠編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是RAF家族成員之一，而且還是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK信號通路中相當重要的轉導因子。BRAF基因突變引起機體患病主要是通過以下兩種途徑：（1）遺傳基因的突變而導致先天性缺陷疾病的途徑；（2）后天獲得致癌基因而導致腫瘤發生或形成的途徑，其生物學功能主要體現在調控細胞生長、分化和凋亡等[9]。

3.2 BRAF基因與甲狀腺癌診斷方面的關系 BRAFFT1799A（V600E）位點與RAS蛋白結合后發生谷氨酸至纈氨酸的點突變，因而引起了MAPK通路中REK和MEK的腫瘤基因的級聯激活反應[10]。迄今為止，V600E點突變是BRAF基因中最常見的遺傳病變，約占乳頭狀癌的45%[11]。而臨床上少見的BRAF基因K601E點突變和AKAP9-BRAF重組常與輻射相關的乳頭狀癌發生有關[12]。研究發現，僅1%～2%乳頭狀癌與此突變相關[11-12]。從組織學上，BRAF顯示出對乳頭狀癌家族的局限性[11]。這在不同的濾泡性乳頭狀甲狀腺癌中幾乎沒有發現。在低分化腫瘤中，BRAF突變越來越多的在去分化頻譜從高分化焦點到大細胞中的低分化區域和孤立的突變和未分化癌中的每一階段被檢測到[13]。這也就為突變既在腫瘤發生起到了早期作用，也在癌癥的生物學去分化中起到作用；同樣的，BRAF也與一定的臨床因素相關，如老年患者的年齡、甲狀腺外腫瘤的轉移、淋巴結轉移、腫瘤的分期、疾病的再發、再手術等[14]。

4 BRAF基因的臨床意義

BRAF基因的意義在于它不僅可作為一種診斷的手段，對預后也有一定的意義。考慮到它與一些侵襲性疾病具有相關性，許多學者提出對于BRAF陽性的甲狀腺癌患者相對于陰性的患者而言具有更強的侵襲性，從而在治療上需要施行甲狀腺全切術加中心淋巴結清除，術后需要更高劑量的放射性碘治療，更低的促甲狀腺激素（thyroid-stimulating hormone，TSH）抑制，并且密切隨訪。分子標記物（如BRAF基因）有助于在細胞形態學不典型和取樣不佳的情況下做出比較有效的診斷，在細胞形態不典型和可疑時對明確腫瘤的性質具有重要意義[15]。近期一項研究表明，BRAF在腫瘤中預測淋巴結的侵襲性可能與腫瘤的大小相關[16]。這項研究對100例為單發病灶的甲狀腺乳頭狀癌患者進行BRAF檢測，根據這100例患者手術所切除腫瘤的大小分成三類：小于0.5 cm、0.5～1 cm、大于1 cm。盡管這三類BRAF的突變率相似，但是BRAF僅僅反映第二組的淋巴結侵襲性。這表明BRAF對亞厘米級的微型癌具有風險評估的意義。

5 展望

細針穿刺細胞學檢查、免疫組化染色（IHC）及RT-PCR檢測技術等對甲狀腺癌的診斷起到了至關重要的作用。從分子生物學角度來講，甲狀腺腫瘤患者體內存在多種分子標記物。但在診斷上，具有明確價值的方法主要是結合外科手術前細胞形態學和分子標記物的檢測結果。另外，也發現在甲狀腺腫瘤患者體內存在一些基因的改變，如BRAF基因分析作為診斷標志已成為診斷甲狀腺腫瘤非常有效的方法，但是它對預后的作用還需進一步的研究[3，10，14，17]。此外，一些基因的突變可能對于甲狀腺癌的預后具有重要意義，如BRAF，這使得很多人對于積極恰當的外科手術和藥物治療某些確定的甲狀腺癌的方法提出了一些質疑[17]。因此，BRAF分子診斷為甲狀腺癌的診斷、治療和預后提供了一個新的方法，進一步的臨床研究為日后正確治療此類疾病提供最佳的診斷方法尤其重要。未來，是否可以將其整合到甲狀腺癌的診斷和治療等各項工作中，值得科研人員和專科醫生進一步的努力。

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（收稿日期：2012-11-22） （本文編輯：陳丹云）