宣肺止嗽方對(duì)感染后咳嗽大鼠氣道神經(jīng)源性炎癥的影響及其機(jī)理研究

李飛俠王 文朱 佳黃厚才夏 智

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210029；2.江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210029；3.江蘇省中醫(yī)藥研究院，江蘇 南京 210028）

宣肺止嗽方為朱佳教授的經(jīng)驗(yàn)方，由炙麻黃5g、杏仁10g、牛蒡子 10g、蟬衣 6g、白前 10g、桑白皮 10g、紫菀 10g、佛耳草15g、全蝎3g、炙甘草5g十味藥組成，具有疏風(fēng)宣肺、止嗽化痰之功效，主為感染后咳嗽（PIC）而設(shè)。感染后咳嗽的發(fā)病機(jī)制尚不甚明確，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為PIC的發(fā)病機(jī)制與氣道神經(jīng)源性炎癥關(guān)系密切[1-3]，其中最主要的是神經(jīng)肽 P 物質(zhì)（SP）、神經(jīng)肽 A（NKA）、神經(jīng)肽 B（NKB）、降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）增高介導(dǎo)的氣道慢性神經(jīng)源性炎癥。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用動(dòng)物模型就該方對(duì)氣道神經(jīng)源性炎癥的作用機(jī)理做一些藥效學(xué)探索研究，以氣道炎癥改變及SP、NKA、NKB、CGRP等作為考察指標(biāo)，旨在從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的角度，更好地挖掘該方的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性純白SD大鼠60只（購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），體重180～220g，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK2010-0001。

1.2 藥物配制 宣肺止嗽方由江蘇省中醫(yī)藥研究院中藥制劑室制備。制備工藝：取麻黃，加水提取2次，每次加藥材10倍量水，提取1h，合并提取液，靜置12h，取上清液，減壓濃縮，浸膏放置備用；另取蟬衣、杏仁、牛蒡子、白前等其余9味，加水提取2次，每次加藥材10倍量水，提取1h，合并提取液，靜置12h，取上清液，減壓濃縮，浸膏與上述浸膏合并，繼續(xù)濃縮至每毫升相當(dāng)于2.604g生藥的浸膏，作為樣品液。惠菲寧止嗽糖漿，惠氏制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：1107016。

1.3 主要試劑與儀器 內(nèi)毒素（LPS）、辣椒素（Cap）購(gòu)自美國(guó) Sigma公司；SP、NKA、NKB和 CGRP酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒，購(gòu)自美國(guó)R&D公司，批號(hào)為 201211。Devilbiss 646型霧化器，購(gòu)自美國(guó)Devilbiss公司，輸出流量為0.037mL/min，輸出口與雙室透明塑料盒的頭室相連接；TP-603T型傳感器，購(gòu)自日本光電公司；華東電子DG5033A酶標(biāo)儀，購(gòu)自南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，購(gòu)自國(guó)華電器有限公司；LOZ5-2型離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；BH-2型Olympus生物顯微鏡（JAPAN）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組及感染后咳嗽模型制備 將60只SPF級(jí)雄性純白SD大鼠隨機(jī)分為6組，即空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（惠菲寧8mL/kg）和宣肺止嗽方低劑量（4.71g/kg）、中劑量（9.42g/kg）、高劑量（13.86g/kg）組，每組 10 只。造模方法按本課題組前期有關(guān)制作感染后咳嗽動(dòng)物模型的研究，參照文獻(xiàn)[4-6]，略有改進(jìn)，具體方法：除空白組以外其余各組大鼠置于特制的0.5m3煙室中，以鋸屑末50g+10支南京牌香煙點(diǎn)燃煙熏，每日熏煙30min，連續(xù)10d，每日1次。自由進(jìn)食、飲水。第11、14、17天用乙醚淺麻醉該5組大鼠后，鼻腔滴入濃度為0.4mg/mL的LPS溶液，滴入量以體重 1μL/g 計(jì)算。第 12、13、15、16、18天， 將該 5組大鼠置于透明密閉容器中以1×10-4mol/L的辣椒素溶液霧化吸入激發(fā)，每次3min，每日1次。每日觀察各組大鼠狀態(tài)，并于第19天開始各組大鼠按10mL/kg的體積灌胃相應(yīng)藥物，空白組給予等體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)給藥15d。于最后1次灌胃后24h處死各組大鼠測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

2.2 支氣管肺泡灌洗液中速激肽及細(xì)胞分類計(jì)數(shù) 將大鼠平放于手術(shù)臺(tái)上，將氣管連同心肺游離出置于臺(tái)上，用血管夾夾閉右主支氣管，將頂端鈍圓有孔的特制硅膠管插入氣管，手術(shù)線結(jié)扎固定。左側(cè)肺給予預(yù)溫37℃的生理鹽水行支氣管肺泡灌洗，反復(fù)抽推3次，留置

1min后回抽BALF并收集，重復(fù)3次，每次2mL，每次回收液體置于冰塊上，經(jīng)過(guò)兩層無(wú)菌紗布過(guò)濾于無(wú)菌離心管，回收計(jì)量（回收率約75%）。1500r/min低溫離心10min，BALF上清保存在-80℃冰箱中，ELISA法檢測(cè)速激肽SP、NKA、NKB及CGRP的含量。沉淀細(xì)胞用0.5mL PBS重懸，吹打均勻后取30μL在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器下進(jìn)行白細(xì)胞總數(shù)計(jì)算；另取30μL制作細(xì)胞涂片，常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下按細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行分類計(jì)數(shù)（至少計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞），求出百分比。

2.3 肺組織病理學(xué)觀察 氣道灌洗完成后，迅速取下各組大鼠右肺，并取出右上葉修剪成0.5cm厚的塊狀，置于4%多聚甲醛固定6h，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，觀察大體組織病變和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。各組結(jié)果以（）表示。組間比較用t檢驗(yàn)（方差齊性），方差不齊時(shí)用t’檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠BALF中細(xì)胞分類計(jì)數(shù) 結(jié)果顯示，各治療組與模型組相比，BALF中各炎癥細(xì)胞比率均降低，以宣肺止嗽方中劑量組最為顯著。見表1。

3.2 各組大鼠BALF中速激肽SP、NKA、NKB及CGRP含量結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組各項(xiàng)指標(biāo)均顯著升高；各治療組BALF中各項(xiàng)指標(biāo)均較模型組降低，以宣肺止嗽方中劑量組最為顯著。見表2。

3.3 肺組織病理變化 空白組：可見支氣管上皮細(xì)胞完整，細(xì)胞呈假?gòu)?fù)層柱狀纖毛上皮，排列整齊，肺泡上皮完整，無(wú)明顯病理改變（見圖1-A）。模型組：可見支氣管上皮大面積壞死脫落，細(xì)支氣管管腔擴(kuò)大，管壁及其周圍見大量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，上皮細(xì)胞明顯增生，杯狀細(xì)胞增生，肺泡間隙稍增厚，未見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（見圖1-B）。陽(yáng)性對(duì)照組：支氣管上皮細(xì)胞多灶壞死、脫落，伴上皮細(xì)胞輕度增生和杯狀細(xì)胞增生，管壁增厚，伴大量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡結(jié)構(gòu)未見明顯損傷（見圖1-C）。宣肺止嗽方低劑量組：可見支氣管上皮細(xì)胞少量的壞死脫落，管壁與周圍淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，管腔無(wú)明顯擴(kuò)張，上皮細(xì)胞無(wú)明顯增生（見圖1-D）。宣肺止嗽方中劑量組：各級(jí)支氣管上皮細(xì)胞基本完好，無(wú)明顯的壞死和增生，伴少量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隙稍增厚，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（見圖1-E）。宣肺止嗽方高劑量組：可見支氣管上皮細(xì)胞中度的壞死脫落，上皮細(xì)胞輕度增生，管壁稍增厚，伴淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，管腔輕度擴(kuò)張，肺實(shí)質(zhì)未見明顯損傷（見圖1-F）。

表1 各組大鼠BALF中細(xì)胞分類計(jì)數(shù)（）

表1 各組大鼠BALF中細(xì)胞分類計(jì)數(shù)（）

注：與空白組比較，▲▲P＜0.01，▲▲▲P＜0.001；與模型組比較，*P＜0.05，***P＜0.001。

組別 動(dòng)物數(shù)（只）劑量（g/kg）白細(xì)胞總數(shù)（×108/L）空白組10巨噬細(xì)胞（%）3.8±1.5淋巴細(xì)胞（%）82.32±2.34中性粒細(xì)胞（%）嗜酸粒細(xì)胞（%）10.78±1.40 6.69±1.510.21±0.077.2±1.5▲▲▲宣肺止嗽方高劑量組 10 13.86g/kg 5.4±1.5* 78.33±3.72*** 13.58±2.37*** 8.07±1.36*** 0.32±0.13模型組 10 66.67±2.50▲▲▲ 21.62±2.13▲▲▲ 11.32±1.48▲▲▲ 0.39±0.15▲▲宣肺止嗽方中劑量組 10 9.42g/kg 3.9±1.4*** 81.93±2.54*** 10.93±1.37*** 6.8±1.55*** 0.24±0.11*宣肺止嗽方低劑量組 10 4.71g/kg 4.2±1.3*** 79.40±2.70*** 12.50±1.38*** 7.71±1.79*** 0.40±0.16陽(yáng)性對(duì)照組 10 8mL/kg 5.9±1.2 72.98±3.12*** 15.73±1.50*** 10.47±1.53 0.33±0.09

表2 各組大鼠BALF中速激肽含量（）

表2 各組大鼠BALF中速激肽含量（）

注：與空白組比較，▲▲▲P＜0.001；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

組別 動(dòng)物數(shù)（只）劑量（g/kg）CGRP含量（pg/ml）160.97±9.6410 SP含量（ng/L）NKB含量（ng/L）空白組模型組 10 232.65±7.10▲▲▲ 73.66±2.98▲▲▲宣肺止嗽方高劑量組 10 13.86g/kg 225.73±3.79* 71.42±1.72宣肺止嗽方中劑量組 10 9.42g/kg 160.56±20.25*** 52.63±1.48***宣肺止嗽方低劑量組 10 4.71g/kg 176.82±21.02*** 59.92±2.16***陽(yáng)性對(duì)照組 10 8mL/kg 228.51±5.05 72.32±1.96 NKA含量（ng/L）158.22±6.85 214.60±13.62201.24±7.00▲▲▲ 279.92±8.25▲▲▲190.74±6.35** 269.86±8.67*157.82±7.32*** 209.83±25.38***170.84±4.73*** 234.22±23.74***195.52±3.90* 269.40±13.5351.13±2.19

4 討論

感染后咳嗽（PIC）是一種較為常見的呼吸道疾病。在美國(guó)ACCP協(xié)會(huì)2006年版 《咳嗽的診斷和治療指南》和中國(guó)2009年版《咳嗽的診斷和治療指南》中，均獨(dú)立將感染后咳嗽歸為亞急性咳嗽。目前普遍認(rèn)為，由支氣管肺C纖維興奮導(dǎo)致其含有的神經(jīng)肽的釋放引起的神經(jīng)源性炎癥在感染后咳嗽發(fā)病中起重要作用[7]。當(dāng)C纖維受到刺激，產(chǎn)生神經(jīng)沖動(dòng)，激發(fā)神經(jīng)遞質(zhì)釋放，從而作用于多種效應(yīng)細(xì)胞，產(chǎn)生神經(jīng)源性炎癥，進(jìn)而刺激RARs引起咳嗽[8-9]。所釋放的神經(jīng)遞質(zhì)主要包括P物質(zhì)、神經(jīng)肽A、神經(jīng)肽B及降鈣素基因相關(guān)肽等，它們通過(guò)多種形式影響氣道組織誘發(fā)神經(jīng)源性炎癥。SP作為氣道神經(jīng)源性炎癥的核心介質(zhì)，在炎癥疾病中的作用目前已經(jīng)非常明確[10]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚缺乏治療該病公認(rèn)有效的藥物，而相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道中醫(yī)藥對(duì)感染后咳嗽有較好的療效，但有關(guān)中藥如何影響本病相關(guān)發(fā)病機(jī)制的研究較少。

本實(shí)驗(yàn)采用小劑量?jī)?nèi)毒素（LPS）誘導(dǎo)模擬革蘭陰性菌感染的方法創(chuàng)建PIC動(dòng)物模型，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組BALF中各類炎癥細(xì)胞比率均顯著升高，上清液中SP、NKA、NKB及CGRP含量均顯著升高，結(jié)合肺組織病理學(xué)改變，可證實(shí)該模型復(fù)制成功。本研究發(fā)現(xiàn)，各治療組大鼠BALF中各類炎癥細(xì)胞比率均降低，以宣肺止嗽方中劑量組最為顯著，其次為低劑量組；各治療組BALF上清液中 SP、NKA、NKB及CGRP含量均較模型組降低，以宣肺止嗽方中劑量組降低最為顯著。

綜上所述，感染后咳嗽的發(fā)病與神經(jīng)遞質(zhì)（以SP、NKA、NKB及CGRP為主）介導(dǎo)的神經(jīng)源性炎癥有關(guān)，這與大部分的研究結(jié)果相似。宣肺止嗽方能降低此類神經(jīng)遞質(zhì)的含量，緩解氣道炎癥，促進(jìn)疾病的恢復(fù)，其中尤以中劑量作用顯著，其次為低劑量，而該方高劑量療效不佳，可能是因?yàn)樗幬餄舛冗^(guò)高存在一定程度的藥物毒性。西藥惠菲寧對(duì)降低此類神經(jīng)遞質(zhì)含量及緩解氣道炎癥無(wú)顯著作用。結(jié)合肺組織病理學(xué)改變，本研究進(jìn)一步證實(shí)了該方對(duì)感染后咳嗽良好的治療效果，并初步探討了相關(guān)作用機(jī)理，為該方的臨床應(yīng)用提供科學(xué)合理的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并提示中藥復(fù)方具有潛在的臨床應(yīng)用前景。

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