阿德福韋酯治療失敗的慢性乙型肝炎患者HBV反轉錄酶區新變異rtN236V的表型耐藥特點分析

王曉，劉妍，思蘭蘭，陳麗，白文林，劉立明，王嫣，許智慧，戴久增，姚增濤，徐東平

核苷(酸)類似物是目前臨床慢性乙型肝炎抗病毒治療的主要藥物，可有效抑制病毒復制，改善肝功能，延緩肝臟疾病的進展，但其作用常因長期服藥引發的耐藥問題而部分甚至全部抵消[1-2]。阿德福韋酯(ADV)是繼拉米夫定(LAM)之后第二種應用于臨床的抗病毒藥物，短期內可有效抑制野生株和LAM耐藥株的復制，但長期服用易產生耐藥，其5年耐藥率可達29%[3]。經典的ADV耐藥突變形式為rtA181V和rtN236T，關于rtN236位點的其他變異目前尚未見國內外文獻報道。本研究采用克隆測序方法對1例ADV治療失敗患者血清病毒池中的HBV反轉錄酶(RT)區基因變異進行鑒定，在rtN236位點檢出了新變異形式rtN236V，并對其表型耐藥特點進行分析，以期豐富臨床對ADV耐藥變異的認識，并為臨床及時調整治療方案提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 病毒DNA提取試劑盒購自北京天恩澤公司；XhoⅠ、SphⅠ內切酶和T4DNA連接酶購自大連寶生物公司；pGEM-Teasy載體購自美國Promega公司；pTriEx-HBV 1.1倍載體由法國里昂大學Zoulim教授惠贈；FuGENE HD轉染試劑購自美國Roche公司；DMEM細胞培養基購自Gibco公司；熒光定量PCR檢測試劑盒購自上海復星公司。克隆測序由北京天一輝遠公司完成。

1.2 研究對象 解放軍302醫院2010年1月收治的1例48歲男性慢性乙型肝炎患者，HBsAg、HBeAg、HBcAb陽性，無重疊或混合感染。診斷標準按2000年9月(西安)全國會議修訂的《病毒性肝炎防治方案》[4]執行，常規檢測項目由本院臨檢中心完成。該患者于2008年10月首次接受ADV抗病毒治療，15個月后出現病毒學突破和生化學突破，血清HBV DNA載量由陰性上升為2.41×105U/ml，ALT由29U/L上升為66U/L。

1.3 方法

1.3.1 HBV RT區基因突變及基因型分析 取凍存于－20℃的患者血清，提取HBV DNA，采用巢式PCR方法擴增HBV RT基因[5]。對PCR產物進行DNA雙向測序，對rt173、rt180、rt181、rt184、rt202、rt204、rt236和rt250位的經典LAM、ADV、恩替卡韋(ETV)相關耐藥位點進行分析[6]。膠回收純化上述PCR產物，與pGEM-Teasy載體連接，轉化JM109感受態細胞，挑選34個菌落PCR鑒定陽性的樣品送測序并分析耐藥突變。按文獻[7]中的方法進行HBV基因分型。

1.3.2 pTriEx-HBV 1.1倍重組載體構建及鑒定 提取含rtN236V、rtN236T和rtA181V+N236V突變形式的質粒及野生型質粒，經XhoⅠ/SphⅠ雙酶切后連接至經同樣酶切后的pTriEx-HBV 1.1載體，連接產物轉化JM109感受態細胞，接種至LB固態瓊脂板(含100μg/ml氨芐西林)，37℃溫箱培養過夜。隨機挑取克隆測序，對重組質粒進行鑒定，制備轉染陽性質粒備用。

1.3.3 細胞轉染及表型耐藥分析 分別提取野生病毒株和突變株重組載體質粒，用FuGENE HD轉染試劑按每孔0.25μg質粒轉染入人肝癌細胞系HepG2細胞中，轉染4h后分別加入不同濃度的LAM(0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L)，ADV(0、0.033、0.1、0.33、1、3.3μmol/L)，ETV(0、0.001、0.01、0.1、1、10μmol/L)和替諾福韋(TDF)(0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L)，隔天換液，換液2次后即轉染第4天收集細胞培養上清，采用實時熒光定量PCR法檢測上清中HBV DNA含量(反映病毒復制力)，計算藥物半數有效劑量IC50及耐藥倍數(突變株與野生株IC50的比值)。

2 結 果

2.1 HBV RT區基因突變檢測及基因分型結果 測序分析顯示該患者HBV RT區耐藥突變為rtN236V/T共存，在34個陽性克隆中，20個(58.8%)為rtN236V變異株，11個(32.4%)為rtN236T變異株，2個(5.9%)為野生株，1個(2.9%)為rtA181V+N236V變異株。分型結果顯示該患者為C2基因亞型HBV感染。

2.2 pTriEx-HBV 1.1倍重組載體的構建及鑒定 如圖1所示，電泳結果顯示2個條帶，即約7000bp的載體片段和1000bp的HBV RT區片段，測序進一步證實載體構建成功。

圖1 4種重組載體的XhoⅠ/SphⅠ雙酶切鑒定Fig.1 Identification of four recombinant plasmids by XhoⅠ/SphⅠ dual-enzyme digestionM. Marker (1kb); 1. rtWT; 2. rtN236T; 3. rtN236V; 4. rtA181V+N236V

2.3 變異HBV復制力測定 實時熒光定量PCR法檢測結果顯示，野生株病毒復制力為(4.00±2.36)×107U/ml，rtN236T、rtN236V和rtA181V+N236V變異株的病毒復制力均有所降低，分別為野生株的89.43%、83.60%和75.44%。

2.4 表型耐藥結果分析 與野生株比較，rtN236T、rtN236V、rtA181V+N236V變異株對LAM、ETV、TDF三種藥物均敏感，而對ADV顯示出不同水平耐藥性。rtN236T株對ADV敏感性降低，其耐藥倍數(變異株EC50/野生株EC50)是野生株的4.75倍；rtA181V+N236V株的耐藥倍數為野生株的5.10倍；rtN236V株對ADV的敏感性介于rtN236T和野生株之間，其耐藥倍數為野生株的3.10倍(表1)。

表1 HBV各變異株及野生株對4種藥物的敏感性Tab.1 Susceptibility of wild-type and mutant HBV to LAM, ADV, ETV and TDF in vitro

3 討 論

核苷(酸)類似物是當前臨床抗HBV治療最常用的藥物，其抗病毒作用靶位是HBV RT區，而對病毒復制初始模板細胞核內的cccDNA沒有直接抑制作用，因此需要長期用藥才可達到持久抑制病毒的目的[8]。HBV是高變異的DNA病毒，可在長期藥物和機體免疫壓力下發生適應性變異，或因預存的極少量變異株獲得選擇性擴增，使耐藥病毒逐漸成為優勢種群，最終導致耐藥，而隨后的病毒學和生化學突破又加速了肝病的進展，嚴重者甚至可引起肝衰竭[9]。ADV是繼LAM之后第二種應用于臨床的核苷酸類藥物，因其可在短期內有效抑制野生病毒及LAM耐藥病毒的復制而在臨床廣泛使用，但長期使用仍可引發耐藥。初治患者ADV的5年耐藥率為29%，針對LAM耐藥患者長期單藥ADV治療后ADV耐藥率明顯增加，4年累積可達43%[2,10-12]。

本例研究對象為2010年1月解放軍302醫院收治的48歲男性慢性乙型肝炎患者，服用ADV 15個月后出現病毒學突破，血清HBV DNA載量由陰性上升為2.41×105U/ml，ALT由29U/L上升為66U/L，克隆測序顯示病毒準種池中含有大量rtN236V變異株，同時伴有rtN236T、rtA181V+N236V及野生株。已知rtA181V和rtN236T是經典的ADV耐藥變異形式[3]，而目前國內外未見有關rtN236位點其他變異的文獻報道，為鑒定新的rtN236V變異是否與ADV耐藥相關，我們進一步分析了rtN236V變異株的體外病毒復制力及表型耐藥特點。

體外實驗結果顯示，與野生株相比，rtN236V、rtN236T、rtA181V+N236V變異株的復制力均有不同程度下降。表型耐藥結果顯示rtN236T、rtA181V+N236V和rtN236V變異株的EC50分別是野生株的4.75、5.10倍和3.10倍。臨床通常將抗病毒藥物的耐藥分為3個級別：耐藥倍數2~9倍為低水平耐藥，10~99倍為中等水平耐藥，大于100倍為強耐藥。但是這一劃分范圍在體外表型耐藥實驗中也存在例外，體外實驗中ADV敏感性小幅度的增長(2~9倍)即可導致耐藥[13]。該患者病毒池中大量存在的rtN236V變異株雖然單獨對ADV耐藥的貢獻較小(3.10倍)，但與經典的rtA181V和rtN236T變異株共同存在時，會協同增加變異株對ADV的耐藥性(5.10倍)，最終導致患者對ADV耐藥，進而出現后續的病毒學和生化學突破。

新的耐藥變異形式鑒定一般要滿足以下幾個過程：首先在臨床病例中發現與藥物應用相關的變異；其次體外實驗證實突變株的病毒適應力；然后表型耐藥實驗分析突變株對抗病毒藥物的耐藥倍數；最后通過長期大樣本的臨床觀察得出最終結論[14-15]。總之，本研究從1例ADV治療失敗的慢性乙型肝炎患者病毒池中鑒定的與rtN236T和rtA181V共同存在的rtN236V變異，可能是一個新的ADV耐藥變異形式。核苷酸類藥物治療過程中及時監測耐藥基因變異，對于及時調整臨床治療方案、提高抗病毒療效具有重要意義。

[1] Zoulim F. Are novel combination therapies needed for chronic hepatitis B[J]? Antiviral Res, 2012, 96(2)∶ 256-259.

[2] Chen CW, Chen CX, Chen SJ. Drug resistance and administration of nucleoside(s) on the treatment of chronic hepatitis B[J]. Chin J Pract Intern Med, 2013, 33(1)∶ 82-91. [陳成偉, 陳從新, 陳士俊, 等. 核苷和核苷酸類藥物治療慢性乙型肝炎的耐藥及其管理[J]. 中國實用內科雜志, 2013, 33(1)∶82-91.]

[3] Segovia MC, Chacra W, Gordon SC. Adefovir dipivoxil in chronic hepatitis B∶ history and current uses[J]. Expert Opin Pharmacother, 2012, 13(2)∶ 245-254.

[4] The Chinese Society of Infectious Diseases and Parasitology,and the Chinese Society of Hepatology of the Chinese Medical Association. Viral hepatitis management scheme[J]. Chin J Hepatol, 2000, 8(6)∶ 324-329. [中華醫學會傳染病與寄生蟲學分會、肝病學分會. 病毒性肝炎防治方案[J]. 中華肝臟病雜志, 2000, 8(6)∶ 324-329.]

[5] Xu DP, Liu Y, Cheng J, et al. Multiple-site analysis of HBV drugresistant mutations in 340 patients with chronic hepatitis B [J].Chin J Hepatol, 2008, 16(10)∶735-738. [徐東平, 劉妍, 成軍,等. 340例慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒多位點耐藥相關突變分析[J]. 中華肝臟病雜志, 2008, 16(10)∶ 735-738.]

[6] Liu Y, Li QH, Li L, et al. Genotypic analysis of Entecavirresistant mutation of hepatitis B virus (HBV) in patients with chronic HBV infection[J]. Med J Chin PLA, 2010, 35(6)∶ 621-624. [劉妍, 李慶虹, 李樂, 等. 慢性HBV感染患者恩替卡韋基因型耐藥突變特征分析[J]. 解放軍醫學雜志, 2010, 35(6)∶621-624.]

[7] Liu Y, Zhong Y, Zou Z, et al. Features and clinical implications of Hepatitis B virus genotypes and mutation in basal core promoter/precore region in 507 Chinese patients with acute and chronic hepatitis B[J]. J Clin Virol, 2010, 47(3)∶ 243-247.

[8] Xu L, Li DY, Wu XY, et al. The changes of the levels of IL-12 and IL-6 in serum of the patients with Chronic Hepatitis B treated with auto-dendritic cell and Adefovir Dipivoxil unionly and clinical significance[J]. Acta Acad Med CPAF, 2011, 20(3)∶ 193-198. [徐麗, 李冬嚴, 吳曉燕, 等. 自體樹突狀細胞聯合阿德福韋酯治療慢性乙型肝炎IL-12和IL-6的水平變化及臨床效應[J]. 武警醫學院學報, 2011, 20(3)∶ 193-198.

[9] Kim JW, Lee HS, Woo GH, et al. Fatal submassive hepatic necrosis associated with tyrosine-methionine- aspartateaspartate-motif mutation of hepatitis B virus after long-term lamivudine therapy[J]. Clin Infect Dis, 2001, 33(3)∶ 403-405.

[10] Peters MG, Hann HW, Martin P, et al. Adefovir dipivoxil alone or in combination with lamivudine in patients with lamivudineresistant chronic hepatitis B[J]. Gastroenterology, 2004, 126(1)∶91-101.

[11] Hadziyannis SJ, Tassopoulos NC, Heathcote EJ, et al. Longterm therapy with adefovir dipivoxil for HBeAg-negative chronic hepatitis B for up to 5 years[J]. Gastroenterology, 2006, 131(6)∶1743-1751.

[12] Chen CH, Wang JH, Lu SN, et al. Characteristics of adefovir resistance in patients with or without lamivudine-resistant hepatitis B virus treated with adefovir∶ a 4-year experience[J].Liver Int, 2011, 31(2)∶ 206-214.

[13] Lok AS, Zoulim F, Locarnini S, et al. Antiviral drug-resistant HBV∶ standardization of nomenclature and assays and recommendations for management[J]. Hepatology, 2007, 46(1)∶254-265.

[14] Xu DP, Liu Y. A novel insight of understanding of mechanism of hepatitis B virus drug resistance by combining genotype resistant mutation detection and phenotype resistance analysis[J]. Med J Chin PLA, 2012, 37(6)∶ 535-538. [徐東平, 劉妍. 結合基因型耐藥突變檢測與表型耐藥分析探索乙肝病毒耐藥的新認識[J]. 解放軍醫學雜志, 2012, 37(6)∶ 535-538.]

[15] Ji D, Liu Y, Li L, et al. The rtL229 substitutions in the reverse transcriptase region of hepatitis B virus (HBV) polymerase are potentially associated with lamivudine resistance as a compensatory mutation[J]. J Clin Virol, 2012, 54(1)∶ 66-72.