他克莫司抑制脂質過氧化對大鼠脊髓的保護效應觀察

潘峰，程艷香，范里，陳安民，郭風勁，李章華，陶鳳華，陶海鷹，孫虹

他克莫司抑制脂質過氧化對大鼠脊髓的保護效應觀察

潘峰，程艷香，范里，陳安民，郭風勁，李章華，陶鳳華，陶海鷹，孫虹

目的探討大鼠脊髓損傷后早期應用他克莫司對脊髓的保護效應。方法健康成年雄性Wistar大鼠40只，隨機分為他克莫司組(n=20)和損傷組(n=20)。采用Allen′s法建立大鼠脊髓損傷模型，他克莫司組在脊髓損傷后5min一次性經尾靜脈注射他克莫司0.3mg/kg，損傷組以相同方法給予等量生理鹽水。傷后3、7、14、21d應用BBB評分法進行后肢運動功能評價，并分別采用黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法測定血漿超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量變化，免疫組織化學染色檢測脊髓組織誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的表達。結果與損傷組比較，他克莫司組各時間點行為學評分明顯改善(P＜0.05或P＜0.01)，血漿MDA含量降低、SOD活性升高(P＜0.05或P＜0.01)。損傷組和他克莫司組iNOS蛋白表達均于傷后3d升高，7d達峰值，且他克莫司組各時間點陽性細胞率均明顯低于損傷組(P＜0.05或P＜0.01)。結論他克莫司可減少大鼠脊髓損傷后iNOS的表達和自由基生成，從而抑制脂質過氧化損傷，改善神經功能。

脊髓損傷；自由基；脂質過氧化作用；他克莫司

創傷性脊髓損傷的病理生理改變是在原發性機械創傷和繼發性損傷共同作用下產生的，就治療時序而言，臨床干預僅限于繼發性損傷過程。近年研究發現，一氧化氮(nitric oxide，NO)等自由基大量生成導致的氧化應激損傷與繼發性脊髓損害密切相關，通過藥物干預自由基誘導的脂質過氧化反應治療脊髓損傷已成為當前的研究熱點之一[1]。我們的前期研究證實，大環內酯類免疫抑制劑他克莫司對脊髓損傷具有神經保護作用，但其機制尚未完全闡明[2]。本研究旨在探討他克莫司對大鼠脊髓損傷后血漿超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量及誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)表達的影響，以明確他克莫司能否通過抑制脂質過氧化反應發揮脊髓保護效應。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 成年雄性健康Wistar大鼠40只，體重200～260g，由武漢大學實驗動物中心提供。隨機分為2組：①他克莫司組(n=20)，脊髓損傷后5min一次性經尾靜脈注射他克莫司0.3mg/kg；②損傷組(n=20)，脊髓損傷后5min一次性經尾靜脈注射等量生理鹽水。

1.2 脊髓損傷模型的制備 大鼠經1%戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射麻醉，損傷組和他克莫司組采用Allen′s法建立脊髓損傷模型：切除T9－T10椎板，用質量為10g的金屬棒從4.0cm高處自由落下撞擊硬膜囊，損傷直徑約3.0mm，金屬棒下落后大鼠迅速出現搖尾反射，雙后肢及軀體回縮撲動后雙后肢呈弛緩性癱瘓，表明撞擊成功，止血后縫合切口。術后小心飼養，每8h人工按壓排尿。

1.3 脊髓功能評分 采用脊髓運動功能BBB(Basso Beattie and Bresnahan)評分法[3]對各組大鼠脊髓損傷后的后肢運動功能進行評定，包括后肢髖、膝、踝關節主動活動范圍，后足負重狀況，前后肢運動協調性，后爪抬起和觸地時腳趾的動作，尾部運動，軀干穩定性等項目，滿分為21分。損傷組和他克莫司組分別在術后3、7、14、21d進行評分，每個時間點各5只。兩名評分者為非本實驗組人員且熟知評分標準，每人分別對一側后肢獨立進行評估，共測定3次，取平均值，若兩人所得分值不等，則再取平均值。

1.4 血漿SOD活性及MDA含量測定 損傷組和他克莫司組各5只大鼠在上述各時間點進行脊髓功能評分結束后經腹腔內麻醉后開胸，經右心室取血3ml，在預冷肝素抗凝試管中混勻，4℃下2000r/ min離心10min，取上清液，–80℃保存。SOD和MDA測定試劑盒均購自南京建成生物研究所。SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法測定，測定波長550nm，MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定，測定波長532nm，具體操作方法按試劑盒說明書進行。721型可見光分光光度計為上海醫用儀器廠產品。

1.5 脊髓標本取材及切片制備 每組5只大鼠在上述各時間點取血完畢后，立即切取以傷段為中心長約8mm的脊髓組織，橫斷為兩等份，任取一半組織投入4%多聚甲醛固定24h，常規石蠟包埋，5μm連續切片。

1.6 免疫組化檢測大鼠脊髓iNOS蛋白表達 兔抗大鼠iNOS多克隆抗體及SABC試劑盒均購自武漢Boster生物工程公司。從各組術后各時間點每只大鼠脊髓組織連續切片中隨機抽取3張，脫蠟至水，3%過氧化氫室溫孵育10min滅活內源性過氧化物酶，正常山羊血清室溫封閉20min，加入兔抗大鼠一抗(1:80稀釋)后4℃過夜，然后滴加生物素化羊抗兔二抗37℃孵育20min，滴加試劑SABC 37℃孵育20min，DAB顯色，蘇木素復染，依次脫水、透明，封固后在光鏡下觀察。以PBS代替一抗作陰性對照。結果判斷：陽性細胞胞質呈棕黃色。計算每張切片的陽性細胞百分比。

1.7 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，計量資料結果以±s表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，進一步兩兩比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 脊髓功能評分 損傷組和他克莫司組大鼠傷后短時間內雙后肢功能完全喪失，動物俯臥位行走，尿潴留。損傷組傷后3d時BBB評分為3.41±1.33；他克莫司組傷后3d時脊髓功能即有所恢復，BBB評分為5.38±1.29，顯著高于損傷組。損傷組和他克莫司組傷后7d大鼠后肢肌力逐漸開始恢復，14d和21d時兩組脊髓功能明顯恢復，但組間差距也增加，至傷后21d兩組評分分別為13.69±1.55和18.44±1.92(表1)。他克莫司組傷后各時間點BBB評分均顯著高于損傷組(P＜0.05或P＜0.01)。

2.2 血漿SOD活性及MDA含量檢測結果 傷后3d損傷組與他克莫司組SOD活性均降至最低點，損傷組下降更為明顯，傷后7～14d逐漸回升，損傷組與他克莫司組間差距增大，至傷后21d，損傷組血漿SOD活性仍未恢復至正常水平，而他克莫司組SOD活性已遠高于損傷組(表1)，各時間點兩組間差異均有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。損傷組血漿MDA水平在傷后3d即有明顯升高，至傷后7d達峰值，然后逐步回落；他克莫司組傷后3d血漿MDA含量升高，但低于損傷組，3～7d維持在相對穩定的水平，然后回落(表1)，兩組在傷后3、7、14d時比較差異有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。

2.3 脊髓組織iNOS蛋白表達水平 iNOS陽性表達主要分布在脊髓前角和中央管周圍的大多角形細胞以及后角的小圓細胞中，根據其形態和分布規律推測主要為神經元和小膠質細胞，另有部分血管內皮細胞亦可見iNOS陽性表達。損傷組傷后3d即可見較多細胞表達iNOS，至7d達峰值，陽性細胞百分比為61.41%±5.36%，之后緩慢下降，至21d仍可觀察到明顯表達。他克莫司組iNOS表達水平低于損傷組，高峰亦發生在傷后7d，陽性細胞百分比為49.03%±5.91%，然后逐步回落(表1，圖1)。兩組在各時間點比較差異均有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。

表1 大鼠傷后不同時間點BBB評分、血漿SOD活性和MDA含量、脊髓組織iNOS表達情況(±s, n=5)Tab. 1 Profiles of BBB score, SOD activity and MDA level in plasma, expression of iNOS in spinal cord-injured rats at different time points (±s, n=5)

表1 大鼠傷后不同時間點BBB評分、血漿SOD活性和MDA含量、脊髓組織iNOS表達情況(±s, n=5)Tab. 1 Profiles of BBB score, SOD activity and MDA level in plasma, expression of iNOS in spinal cord-injured rats at different time points (±s, n=5)

(1)P＜0.05, (2)P＜0.01 compared with injury group; (3)P＜0.05, (4)P＜0.01 compared with 3d; (5)P＜0.05, (6)P＜0.01 compared with 7d; (7) P＜0.01 compared with 14d

14 21 BBB score Injury group 3.41±1.33 7.64±0.88(4) 12.49±1.71(4)(6) 13.69±1.55(4)(6)Tacrolimus group 5.38±1.29(1) 10.05±1.42(1)(4) 17.27±1.85(2)(4)(6) 18.44±1.92(2)(4)(6)SOD activity (U/ml) Injury group 36.65±12.11 82.57±11.01(4) 112.38±14.10(4)(6) 127.43±10.85(4)(6)Tacrolimus group 54.85±8.26(1) 143.78±17.09(2)(4) 175.62±18.18(2)(4)(6) 186.46±19.48(2)(4)(6)MDA level (nmol/ml) Injury group 7.87±0.62 8.51±0.76 6.13±0.56(4)(6) 3.89±0.60(4)(6)(7)Tacrolimus group 6.55±0.40(2) 6.42±1.11(2) 5.30±0.44(1)(4)(5) 3.17±0.21(4)(6)(7)Expression of iNOS protein (%) Injury group 52.70±6.33 61.41±5.36(3) 45.47±6.24(6) 30.13±5.16(4)(6)(7)Tacrolimus group 39.74±4.87(2) 49.03±5.91(2)(3) 31.48±5.74(2)(3)(6) 21.09±4.22(1)(4)(6)(7)Item Time after operation (d) 3 7

圖1 兩組大鼠傷后3d脊髓組織中iNOS的表達情況(免疫組化染色 ×200)Fig. 1 iNOS expression in myeloid tissue 3 days after rat injury (Immunohistochemistry staining ×200)

3 討 論

哺乳動物體內有3種NOS亞型。Ⅰ型和Ⅲ型在體內恒定表達，稱為固有型NOS(constitutive NOS，cNOS)，其活性依賴于Ca2+濃度。Ⅱ型即iNOS，在各種刺激下誘導生成[4]，其活性不依賴于Ca2+濃度，在正常生理狀態下含量極低[5]，但脊髓損傷后，隨著中性粒細胞等炎癥細胞的浸潤及炎癥因子的產生，iNOS表達逐漸增加。由于iNOS不依賴于Ca2+即可與鈣調蛋白緊密結合，通過級聯放大作用產生大量NO，遠超過cNOS作用下產生的NO量。NO與氧及活性氧中間產物、巰基化合物相互作用產生其他生物活性分子，如ONOO－、NO＋及，導致脂質過氧化反應增強，引起嚴重的細胞氧化損傷[1]。同時NO本身也可通過多種方式誘導細胞凋亡[6]。Xu等[7]應用免疫組化和Western blotting方法檢測脊髓損傷后iNOS及蛋白氧化應激代謝產物亞硝基酪氨酸的表達發現，兩者均于損傷后1d增加，7d達峰值，且iNOS表達水平與其活性水平在時間變化上相一致。Moon等[8]發現當歸根提取物通過抑制iNOS的表達，可減輕脊髓損傷后氧化應激導致的神經細胞凋亡，促進神經功能恢復。本實驗結果顯示，脊髓損傷后iNOS表達明顯增加，于傷后7d達峰值，至21d仍維持在較高水平，而傷后早期給予他克莫司可顯著降低iNOS表達，提示iNOS表達上調可能在脊髓損傷的發生發展中起重要作用，iNOS表達受抑可能參與了他克莫司的神經保護作用。

脊髓損傷后組織缺血、缺氧，iNOS表達上調，產生并釋放大量包括活性NO族在內的自由基。自由基含有不配對電子，性質極不穩定，極易攻擊生物膜上多價不飽和脂肪酸的丙烯雙鏈，形成連鎖式的鐵離子依賴性脂質過氧化反應，破壞膜結構的通透性和完整性，其中NO與超氧負離子相互作用產生高反應活性的－OH和ONOO－，引發更為嚴重的細胞氧化損傷[1]。MDA為脂質過氧化的代謝終產物，可反映體內自由基的生成和脂質過氧化水平，SOD為自由基的清除劑，通過催化歧化反應，保護細胞免受過氧化損傷，兩者是目前公認的反映自由基生成及脂質過氧化反應程度的指標[9]。Kanter等[10]研究證實脊髓損傷后MDA含量增高，SOD活性下降，二者呈負相關，與本研究損傷組的測定結果一致，提示脊髓損傷后自由基生成增加、脂質過氧化反應增強。Fan等[11]研究發現提高SOD活性對脊髓損傷有明顯的保護作用，本實驗他克莫司組SOD活性高于損傷組、脊髓功能BBB評分優于損傷組亦為其提供了佐證，說明脊髓損傷早期應用他克莫司抑制和清除自由基可促進后期功能恢復。此外，本研究選擇SOD和MDA作為衡量脊髓損傷后自由基生成及脂質過氧化反應程度的指標，而未直接檢測血漿或脊髓組織中NO自由基的生成水平，這主要是基于如下考慮：①NO的半衰期極短，生成后即與活性氧族相互作用生成其他活性分子[12]，因而難以準確測量；②NO引起的氧化損傷并不僅僅限于其本身，前已述及，NO與氧及活性氧中間產物等相互作用產生的ONOO－、NO＋等可導致更為嚴重的細胞氧化損傷，因此NO及其衍生物共同參與了脊髓繼發性損傷過程，僅對NO水平進行檢測有失偏頗，而SOD和MDA含量測定則能全面反映脊髓損傷后自由基的生成水平及其引發的脂質過氧化損傷的程度。

本課題組前期研究證實他克莫司可減少脊髓損傷后的神經細胞凋亡[2]。Yousuf等[13]在大鼠脊髓背側柱缺氧損傷模型中發現，他克莫司可通過抗氧化作用保護線粒體功能，減少梗死面積。本實驗結果顯示，他克莫司組脊髓損傷后iNOS表達和血漿MDA含量明顯低于損傷組，而SOD活性顯著高于損傷組，表明他克莫司可抑制傷后iNOS表達，減少NO等自由基的生成，提高SOD活性，減輕脂質過氧化反應，而進一步的脊髓功能評分顯示，傷后各時間點他克莫司組BBB評分均顯著高于損傷組，表明脊髓損傷后早期應用他克莫司可有效抑制自由基生成及脂質過氧化反應，減輕其對神經細胞的氧化損傷，促進脊髓損傷后的功能恢復。同時本研究還發現，脊髓損傷后SOD活性最低點與MDA含量最高點之間存在一個時間差，提示他克莫司提高SOD活性只能減輕而不能完全阻止脂質過氧化反應，因此，還需通過其他途徑從多個方面抑制自由基產生及其導致的細胞氧化損傷。

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Neuroprotective effect of tacrolimus on injured spinal cord of rats via attenuating lipid peroxidation

PAN Feng1, CHENG Yan-xiang2, FAN Li1, CHEN An-min3, GUO Feng-jing3, LI Zhang-hua1, TAO Feng-hua1, TAO Haiying1, SUN Hong1
1Department of Spine Surgery,2Department of Gynaecology and Obstetrics, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China
3Department of Orthopaedics, Tongji Hospital, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China
This work was supported by the Provincial Natural Science Foundation of Hubei (2012FFB04406)

ObjectiveTo study the neuroprotective effect of tacrolimus on early injury of rats′ spinal cord and its underlying mechanism.MethodsForty-five healthy male Wistar rats were randomly divided into injury group (n=20) and tacrolimus group (n=20). The rats in the two groups were subjected to contusion of spinal cord injury (SCI) at the T10level with weight-drop impact (Allen′s method). Animals in tacrolimus group were administered with tacrolimus (0.3mg/kg) 5min intravenously after SCI, while those in the injury group

equal volume of normal saline. BBB scales were used to assess the neurological function of hind limbs 3, 7, 14, and 21 days after SCI. Superoxide dismutase (SOD) activity and malonaldehyde (MDA) level in the plasma were measured by xanthine oxidase and thiobarbituric acid (TBA) method respectively. The expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in spinal cord was detected by immunohistochemistry staining.ResultsThe BBB score was significantly higher, the plasma MDA level was obviously lower and SOD activity was remarkably higher in tacrolimus group than those in injury group (P＜0.05, P＜0.01). The expression of iNOS protein in spinal cord began to increase on the 3rd day after SCI and reached the peak at the 7th day in both injury and tacrolimus group, and the iNOS positive cell rate was significantly lower in tacrolimus group than in injury group at each time point (P＜0.05, P＜0.01).ConclusionTacrolimus may inhibit the expression of iNOS and decrease the generation of free oxygen radicals after SCI, thus attenuate lipid peroxidation and improve neurological function.

spinal cord injuries; free radicals; lipid peroxidation; tacrolimus

R651.21

A

0577-7402(2013)04-0279-04

2012-10-15；

2013-02-21)

(責任編輯：胡全兵)

湖北省自然科學基金(2012FFB04406)

潘峰，醫學博士，主治醫師。主要從事脊柱脊髓損傷的基礎與臨床研究

430060 武漢 武漢大學人民醫院脊柱外科/骨一科(潘峰、范里、李章華、陶鳳華、陶海鷹、孫虹)，婦產科(程艷香)；430030 武漢 華中科技大學附屬同濟醫院骨科(陳安民、郭風勁)