Cripto-1在食管癌組織中的表達及其與上皮間質轉化的關系

陳旺盛，傅仲學，黃春，文坤明，錢江，馮繼紅，李雷

食管癌(esophageal carcinoma)是常見的消化道惡性腫瘤，預后差，病死率高[1-2]。我國是食管癌高發國家，研究食管癌的發生、發展具有重要意義。Cripto-1又稱畸胎瘤衍生因子-1(teratocarcinoma-derived growth factor-1，TDGF-1)，是表皮生長因子-CFC家族成員之一。研究發現Cripto-1可通過促進腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲、血管生成以及誘導上皮-間質轉化(epithelialmesenchymal transition，EMT)而在多種惡性腫瘤的發生、發展中起重要作用[3-8]。本研究通過檢測Cripto-1、上皮標記物E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、間葉標記物N-鈣黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(vimentin)在食管癌中的表達，探討Cripto-1在食管癌發生、發展過程中的作用及其與EMT的關系。

1 材料與方法

1.1 標本 收集2011年4－9月在重慶醫科大學附屬第一醫院胸心外科行手術治療的41例食管癌患者的癌灶中心組織、癌旁(距癌灶邊緣5cm以內)組織及正常食管黏膜(手術切緣經病理證實無腫瘤細胞)組織標本。41例患者中，男28例，女13例，年齡42～75歲，平均54歲，所有患者術前均未進行新輔助放/化療及生物治療，均經病理檢查明確診斷。標本離體后迅速采集并分為兩份，一份置于液氮中，24h后轉入－80℃冰箱保存，另一份用10%中性甲醛固定備用。

1.2 主要試劑 兔抗人Cripto-1、N-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白、波形蛋白單抗購自美國Epitomics公司；內參GAPDH一抗購自北京四正柏生物科技有限公司；山羊抗兔二抗、凱基全蛋白提取試劑盒購自凱基生物科技有限公司；Western blotting配膠試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、ECL發光試劑盒、PVDF膜購自江蘇碧云天公司；SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、中性樹膠、蘇木素染液購自北京康為世紀公司；磷酸鹽緩沖液、枸櫞酸鈉抗原修復液購自北京中杉金橋生物技術有限公司；Trizol、RTPCR反轉錄試劑盒、Premix Taq酶、DNA Marker購自TaKaRa(大連寶生物)公司。

1.3 RT-PCR檢測Cripto-1 mRNA的表達 按照Trizol試劑盒說明書提取組織總RNA，采用TaKaRa公司反轉錄試劑盒合成cDNA。反應條件：94℃3min；94℃ 30s，61℃ 30s，72℃ 30s，40個循環；72℃ 4min。PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分離，采用Bio-Rad凝膠成像儀成像，Quantity-One軟件對條帶吸光度值進行半定量分析，以目的條帶吸光度值/內參條帶吸光度值的比值作為目的基因的相對表達量。引物由北京華大基因設計并合成，相關引物序列如下：Cripto-1上游引物5'-CACGATGTGCGCAAAGAGA-3'，下游引物5'-TGACCGTGCCAGCATTTACA-3'，擴增長度89bp；GAPDH上游引物5'-AAGGTGAAGGTCGGAAC-3'，下游引物5'-GGGGTCATTGATGGCAACAAT-3'，擴增長度102bp。

1.4 Western blotting檢測Cripto-1蛋白表達 提取組織總蛋白，BCA法定量。上樣量40μg，采用10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，采用濕法轉膜(1kD/min)至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉液封閉1h后加入一抗，抗體的稀釋比例Cripto-1為1∶2000，GAPDH為1∶5000，4℃孵育過夜，TBST洗膜后加入山羊抗兔二抗(1∶5000)，室溫孵育1h，TBST洗膜后ECL發光。用Quantity-One軟件對條帶的吸光度值進行半定量分析，以目的蛋白條帶的吸光度值/內參GAPDH蛋白條帶的吸光度值的比值表示目的蛋白的相對量。

1.5 免疫組化檢測Cripto-1、N-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白、波形蛋白的表達 所有標本經10%中性甲醛固定，石蠟包埋，4μm連續切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，0.01mol/L枸櫞酸鈉緩沖液抗原熱修復，內源性過氧化物酶37℃封閉20min；加一抗(抗體稀釋比例Cripto-1為1∶200，N-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白、波形蛋白為1∶250)，4℃孵育過夜；加二抗37℃孵育30min；加入辣根過氧化物酶(HRP)37℃孵育20min；DAB顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下檢測并拍照。染色結果根據陽性細胞染色強度及陽性細胞百分數進行分級[9]。陽性細胞百分數＜5%為0分，5%~25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；細胞染色強度：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。陽性強度為兩種計分乘積：0～2分為陰性(－)、3～5分為弱陽性(+)、6～8分為陽性()、9～12分為強陽性()。結果判定由兩位病理科醫師分別進行，取平均值。

1.6 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，進一步兩兩比較采用Tukey檢驗，相關性分析采用Spearman分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

圖1 Cripto-1 mRNA相對表達水平檢測Fig.1 Expression of Cripto-1 mRNA detected by RT-PCR1. Esophageal carcinoma; 2. Paraneoplastic tissue; 3. Normal esophageal tissue

2.1 Cripto-1 mRNA表達檢測結果 Cripto-1 mRNA在食管癌組織中的表達(0.35±0.08)明顯高于癌旁組織(0.22±0.04)及正常食管黏膜組織(0.13±0.03，P＜0.05)，而癌旁組織與正常食管黏膜組織中的表達差異無統計學意義(P＞0.05，圖1)。

2.2 Cripto-1蛋白表達檢測結果 Cripto-1蛋白在食管癌組織中的表達(0.62±0.06)明顯高于癌旁組織(0.45±0.07)及正常食管黏膜組織(0.33±0.05，P＜0.05)，而癌旁組織與正常食管黏膜組織中的表達差異無統計學意義(P＞0.05，圖2)。

圖2 Cripto-1蛋白表達水平檢測Fig.2 Expression of Cripto-1 protein detected by Western blotting 1. Esophageal carcinoma; 2. Paraneoplastic tissue; 3. Normal esophageal tissue

2.3 Cripto-1、N-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白、波形蛋白表達的免疫組化檢測結果 Cripto-1、N-鈣黏蛋白陽性著色位于細胞膜和細胞質，E-鈣黏蛋白陽性著色位于細胞膜，波形蛋白陽性著色位于細胞質(圖3)。Cripto-1、N-鈣黏蛋白、波形蛋白、E-鈣黏蛋白在食管癌組織中的陽性表達率分別為53.7%、51.2%、61.0%、36.6%。

2.4 Critpo-1在食管癌中的表達與臨床病理資料的關系 Cripto-1在不同性別、年齡、侵襲范圍及臨床分期中的表達情況見表1。統計學分析顯示，Cripto-1在食管癌中的表達與患者的年齡、性別和浸潤范圍無顯著相關性(P＞0.05)，與淋巴結轉移、遠處轉移及臨床分期顯著相關(P＜0.05，表1)。

圖3 Cripto-1、N-鈣黏蛋白、波形蛋白、E-鈣黏蛋白在食管癌組織中的表達(SP ×400)Fig.3 Expression of Cripto-1, N-cadherin, vimentin, E-cadherin protein in esophageal carcinoma tissue (SP ×400)A. Cripto-1; B. N-cadherin; C. Vimentin; D. E-cadherin

表1 食管癌組織中Cripto-1蛋白表達與臨床病理資料的關系(n=41)Tab.1 Relationship between the expression of Cripto-1 protein and clinical pathological parameters in esophageal carcinoma tissue (n=41)

2.5 Cripto-1蛋白與N-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白、波形蛋白表達的相關性 Spearman相關分析顯示，食管癌組織中Cripto-1的表達與N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達呈正相關(r=0.463，r=0.460，P＜0.05)，與E-鈣黏蛋白的表達呈負相關(r=－0.310，P＜0.05，表2)。

表2 食管癌中Cripto-1與N-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白、波形蛋白表達的相關性分析Tab.2 The correlation between the expression of Cripto-1 and N-cadherin, E-cadherin, Vimentin in esophageal carcinoma

3 討 論

Cripto-1基因位于人常染色體3p21.3，是表皮生長因子-CFC家族成員之一，最先由人畸胎瘤cDNA文庫中分離出來，因此又稱TDGF-1，具有調節細胞分化及胚胎發育的功能。Cripto-1在成人組織中的表達水平非常低，但在細胞發生惡變時的表達水平明顯增高[3]。研究發現Cripto-1在多種惡性腫瘤，如胃癌、結腸癌、肺癌、乳腺癌、宮頸癌、皮膚黑色素瘤及口腔鱗狀細胞癌等組織中過表達，而在正常組織中不表達或低表達[3-5]，提示Cripto-1表達增高可能是這些惡性腫瘤發生過程中的早期事件。體外研究表明，過表達Cripto-1可提高人乳腺癌細胞的生長速度、抗凋亡及遷移、侵襲能力[6]；體內研究發現，與對照組比較，Cripto-1基因沉默后的人鼻咽癌CNE-2細胞小鼠移植瘤生長明顯受抑[7]。

本研究通過RT-PCR和Western blotting檢測41例食管癌患者的癌組織、癌旁組織及正常食管黏膜組織中Cripto-1蛋白及mRNA表達情況，結果顯示，Cripto-1 mRNA及蛋白在食管癌組織中的表達均高于癌旁組織和正常食管黏膜組織(P＜0.05)，提示Cripto-1可能在食管癌的發生中發揮作用，檢測其表達水平可能為食管癌的早期診斷提供參考。

Cripto-1不僅與腫瘤的發生有關，還與腫瘤的侵襲轉移潛能有關[3]。本研究采用免疫組化方法檢測了Cripto-1在食管癌組織中的表達，并分析了其與患者臨床病理資料的關系，結果顯示Cripto-1在食管癌中的表達與患者的年齡、性別和浸潤范圍無明顯相關(P＞0.05)，但與淋巴結轉移、遠處轉移及臨床分期(TNM)顯著相關(P＜0.05)，提示Cripto-1在食管癌的侵襲、轉移過程中可能具有重要作用，檢測食管癌組織中Cripto-1表達水平可能對食管癌的惡性程度評估及預后判斷有一定參考價值。

Strizzi等[10]發現Cripto-1在體外鼠乳房上皮細胞和體內鼠乳房腫瘤細胞中可通過調控EMT的發生而促進侵襲和轉移。EMT是具有極性的上皮細胞轉換成能夠在細胞基質間自由移動的細胞的過程，細胞在此過程中獲得浸潤和遷移的能力[11]。EMT是腫瘤侵襲、轉移的主要機制之一，以上皮細胞極性的消失及間質特性的獲得為重要特征[12-13]。E-鈣黏蛋白是常用的上皮標志物，而N-鈣黏蛋白和波形蛋白是較為公認的間質標記物。我們采用免疫組化檢測食管癌組織EMT標記物表達情況，并對Cripto-1與EMT標記物間的相關性進行分析，結果顯示食管癌組織中Cripto-1表達與N-鈣黏蛋白表達呈正相關(r=0.463，P＜0.05)，與波形蛋白表達呈正相關(r=0.460，P＜0.05)，與E-鈣黏蛋白表達呈負相關(r=－0.310，P＜0.05)，提示Cripto-1可能通過調控間質和上皮細胞標記物的表達而促進EMT的發生，從而在食管癌的侵襲、轉移中發揮重要作用。

綜上所述，Cripto-1在食管癌的發生和侵襲轉移過程中發揮了重要作用，可為食管癌的早期診斷、分子靶向治療及預后判斷提供重要參考。EMT的發生是多種基因、蛋白和微環境共同作用的復雜過程，Cripto-1可能與受其調控的EMT共同參與了腫瘤的侵襲轉移，但具體機制有待進一步研究。

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