Ascl2表達抑制對結腸癌細胞上皮-間質轉化的影響

田音，朱蓉，汪榮泉

上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮細胞在特定的生理和病理情況下向間質細胞轉化的現象[1]。EMT也是腫瘤浸潤、轉移的一個非常重要的機制[2]。在EMT過程中表達下調的因子主要為上皮性標志物如E-鈣黏蛋白(E-cadherin)，表達上調的因子主要為間質性標志物如波形蛋白(vimentin)[3]。Ascl2(achaete scute-like 2)是一個堿性/螺旋-環-螺旋轉錄因子，其表達僅限于胎盤及Lgr5陽性的腸隱窩基底柱細胞(crypt base columnar cells，CBC cells)[4]。小鼠基因過表達和基因敲除模型研究揭示Ascl2是控制CBC細胞干性的一個重要的轉錄因子，在小鼠腸上皮中的過表達可誘導腸隱窩過度增生及腸絨毛上異位隱窩的出現，而Ascl2基因誘導缺失可導致成體小鼠腸道Lgr5陽性的CBC細胞消失[4]。近來有研究發現，Ascl2在結直腸癌發生發展的各個時期以及其他多種腫瘤中均表達上調[5-6]，在人結腸癌細胞系中干擾Ascl2的表達可導致細胞周期G2/M期阻滯[7]，同時Ascl2作為Wnt信號在腸道內的轉錄靶點，可抑制結直腸腫瘤中的Wnt信號通路，早期腸道腫瘤中Wnt信號通路的失調與Ascl2的過度表達相關[4]。因此我們設想Ascl2可能與結腸癌干細胞的干性相關。前期實驗已證實，Ascl2在維持結腸癌干細胞自我更新方面發揮著重要作用[8]。有研究顯示，EMT及其逆轉過程MET(mesenchymal-epithelial transition)在胚胎發育、腫瘤進展及轉移中起著重要的調節作用，EMT與正常及腫瘤細胞干細胞特性的獲得有關[9-11]。Ascl2調節腫瘤干細胞干性的同時是否影響EMT目前尚不清楚。本研究對結腸癌HT29和LS174T細胞進行Ascl2 RNA干擾并建立穩定轉染的細胞系，探討Ascl2對結腸癌細胞EMT的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 人結腸癌細胞株HT-29購自中國科學院上海細胞庫，人結腸癌細胞株LS174T由第三軍醫大學消化病研究所保種(均引自ATCC)；Macoy's 5A培養基購自Sigma公司；胎牛血清(FBS)購自Hyclone公司；LipofectamineTM2000和Trizol試劑購自Invitrogen公司；反轉錄和熒光定量PCR試劑購自大連寶生物工程有限公司；抗Ascl2單克隆抗體購自Millipore公司；抗E-鈣黏蛋白單克隆抗體購自Abcam公司；抗波形蛋白單克隆抗體購自Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG(H+L)購自碧云天公司；辣根過氧化物酶標記的兔抗山羊IgG(H+L)購自中杉金橋生物公司。

1.2 干擾質粒的構建與測序 干擾質粒shRNAAscl2/EGFP以及對照質粒shRNA-Ctr/EGFP由武漢晶賽生物工程有限公司合成。Ascl2干擾序列為CCGCGTGAAGCTGGTGAAC[1]，由此設計合成的DNA模板引物為：上游引物5'-CACCGCCGCGTGA AGCTGGTGAACTTCAAGACGGTTCACCAGCTTC ACGCGGTTTTTTG-3'，下游引物5'-AGCTCAAAA AACCGCGTGAAGCTGGTGAACCGTCTTGAAGTT CACCAGCTTCACGCGGC-3'。采用Real-time PCR及Western blotting檢測轉染干擾質粒之后Ascl2的表達情況。

1.3 穩定轉染細胞系的建立 HT-29和LS174T細胞用含10%胎牛血清的Macoy's 5A完全培養液進行常規培養，當細胞生長至50%~60%融合時，按LipofectamineTM2000轉染試劑說明書進行轉染。轉染干擾質粒48h后激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光表達情況，結果顯示轉染效率均低于20%，進一步行G418篩選以建立穩定轉染的細胞系。HT-29和LS174T細胞的G418篩選濃度分別為800、400μl/ml，維持濃度分別為400、200μl/ml。

1.4 MTT比色法檢測細胞增殖情況 將細胞消化、離心，吹散為單細胞懸液，接種于96孔板，每孔1×104個細胞(100μl)，分別培養24、48、72、96h，然后加入5mg/ml MTT溶液20μl，繼續培養4h、吸棄上清，加入DMSO 150μl，震蕩10min，使結晶顆粒充分溶解，酶標儀測定490nm波長處的吸光度(A)值。實驗重復3次。

1.5 平板克隆形成實驗 將細胞消化、離心，吹散為單細胞懸液，以1000個/孔接種于35mm培養皿中，每個培養皿加入含20%血清的完全培養液2ml，并使細胞分散均勻，每組設3個復孔，每3d換液1次，共培養20d；加入2ml甲醇，固定20min，PBS洗3遍，每個培養皿加入Giemsa染液2ml，染色20min，PBS沖洗3遍，自然干燥，拍照，倒置顯微鏡下觀察并計算克隆數。＞50個細胞計為1個克隆。克隆形成率=(陽性克隆數/接種細胞數)×100%。

1.6 Real-time PCR檢測E-鈣黏蛋白和波形蛋白mRNA的表達 按Trizol試劑說明書方法提取總RNA，Real-time PCR引物由大連寶生物工程有限公司合成。E-鈣黏蛋白引物序列為：上游5'-TGCACTGCCCAGGAGCCAGA-3'，下游5'-TGGCACCAGTGTCCGGATTA-3'，片段大小103bp；波形蛋白引物序列為：上游5'-TGAGTACCGGAGACAGGTGCAG-3'，下游5'-TAGCAGCTTCAACGGCAAAGTTC-3'，片段大小119bp。按照試劑盒說明書進行反轉錄，反應條件為：37℃ 15min，85℃ 5s。Real-time PCR反應體系為20μl，反應條件為：95℃ 10s；95℃ 5s、60℃20s，40個循環；55℃ 10s，80個循環。

1.7 Western blotting檢測E-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達 采用SDS裂解緩沖液裂解HT-29和LS174T細胞，BCA法定量，取全細胞裂解液20μg，按照4∶1比例加入0.5mol/L DTT，煮沸5min變性，上樣，電泳，電轉，5% BSA室溫封閉2h，加入抗E-鈣黏蛋白抗體(1∶1000)或抗波形蛋白抗體(1∶300)，4℃過夜，洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG(1∶1 000)或兔抗山羊IgG(1∶10 000)，室溫孵育1.5h，洗膜，免疫復合物經化學發光顯色，凝膠成像儀成像。采用Quantity-One軟件對條帶光密度值進行分析，蛋白的相對定量結果以實驗條帶光密度值/β-actin條帶光密度值表示。

1.8 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行數據處理。計量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 干擾質粒的構建及穩定轉染細胞系的建立將構建的載體進行測序驗證，結果表明干擾質粒的目的片段與預期完全相符。G418篩選后成功建立了shRNA-Ascl2/HT-29、shRNA-Ctr/HT-29、shRNAAscl2/LS174T和shRNA-Ctr/LS174T等4個穩定轉染的細胞系。

2.2 Ascl2干擾效果檢測 對HT-29(mock)、shRNA-Ctr/HT-29、shRNA-Ascl2/HT-29、LS174T(mock)、shRNA-Ctr/LS174T和shRNA-Ascl2/LS174T細胞進行Ascl2 mRNA和蛋白表達水平的檢測，結果顯示，轉染干擾質粒之后Ascl2 mRNA和蛋白表達均明顯下降(P＜0.01，圖1)。

2.3 Ascl2干擾后HT-29和LS174T細胞增殖情況MTT檢測結果顯示，Ascl2干擾后的HT-29和LS174T細胞增殖率在72h及96h時間點明顯低于未轉染及轉染對照質粒的HT-29和LS174T細胞(P＜0.05，圖2)。

2.4 Ascl2干擾后HT-29和LS174T細胞克隆形成情況 細胞培養20d后，轉染Ascl2干擾質粒的HT-29和LS174T細胞克隆形成數明顯少于未轉染及轉染對照質粒的細胞(P＜0.05，圖3)。

2.5 Ascl2干擾后HT-29和LS174T細胞E-鈣黏蛋白和波形蛋白的mRNA及蛋白表達情況 Real-time PCR結果顯示，干擾后E-鈣黏蛋白mRNA和蛋白表達均明顯高于未轉染及轉染對照質粒的細胞，波形蛋白mRNA和蛋白表達均明顯低于未轉染及轉染對照質粒的細胞(P＜0.05，圖4、5)。

圖1 轉染Ascl2干擾質粒后Ascl2 mRNA(A)和蛋白(B)表達情況Fig.1 Expression of Ascl2 mRNA (A) and protein (B) after transfected with shRNA-Ascl2 vector(1)P＜0.01 compared with mock and shRNA-Ctr

圖2 Ascl2干擾后HT-29和LS174T細胞增殖情況(MTT檢測)Fig.2 Cell proliferation of HT-29 and LS174T cells after transfected with shRNA-Ascl2 vector(1)P＜0.05 compared with HT-29 and shRNA-Ctrl/HT-29; (2)P＜0.05 compared with LS174T and shRNA-Ctrl/LS174T

圖3 Ascl2干擾后HT-29和LS174T細胞克隆形成情況檢測Fig.3 The formed clone numbers of HT-29 and LS174T cells after transfected with shRNA-Ascl2 vector(1)P＜0.05 compared with mock and shRNA-Ctr

圖4 Ascl2干擾后HT-29和LS174T細胞E-鈣黏蛋白和波形蛋白mRNA表達情況Fig.4 Expression of E-cadherin(A) and vimentin(B) mRNA in HT-29 and LS174T cells after transfected with shRNA-Ascl2 vector(1)P＜0.05 compared with mock and shRNA-Ctr

圖5 Ascl2干擾后HT-29細胞(A)和LS174T細胞(B)E-鈣黏蛋白和波形蛋白蛋白表達情況Fig.5 Expression of E-cadherin and vimentin protein in HT-29 (A) and LS174T(B) cells after transfected with shRNAAscl2 vector

3 討 論

結腸癌是我國常見的惡性腫瘤之一，且預后不良，病死率較高[12]。結腸癌現有的治療方法包括手術切除、化療等均難以徹底根治，因此尋找新的治療方法勢在必行。目前隨著基礎研究成果向臨床應用的轉化加速，以及腫瘤個體化治療、維持治療等觀念的更新，腫瘤已成為可控制的慢性病[4]。

我們前期的研究顯示，Ascl2在維持結腸癌干細胞的自我更新方面發揮著重要作用，Ascl2干擾后，HT-29和LS174T細胞的增殖減慢，細胞遷移和侵襲能力減弱，體外成瘤能力下降[9]。Ascl2作為Wnt信號通路的一個重要轉錄因子，目前已被證實是正常成體腸干細胞的一個重要標志物，并且控制著腸干細胞的命運[5]，并有研究發現該因子在結腸癌標本中表達上調[6-7]。

EMT是近年腫瘤發生過程中的一個研究熱點，有學者認為它是腫瘤轉移的起始事件[13-15]，其中鈣黏蛋白轉換和轉錄因子表達上調是EMT發生過程中重要的分子事件[16]。但Ascl2與結腸癌細胞EMT是否相關及其機制目前尚不清楚。本研究將Ascl2的shRNA干擾質粒轉染入結腸癌HT-29和LS174T細胞，并通過G418篩選建立了穩定轉染的細胞系。MTT和平板克隆形成實驗觀察發現，Ascl2干擾后HT-29和LS174T細胞增殖速率和克隆形成能力均明顯下降，EMT相關蛋白E-鈣黏蛋白的mRNA和蛋白表達水平均上調，波形蛋白mRNA和蛋白表達水平均下調，說明Ascl2干擾后逆轉了結腸癌細胞的EMT，提示Ascl2可能通過EMT促進結腸癌細胞的侵襲轉移，在結腸癌的惡性進展中發揮重要作用，但Ascl2通過何種機制調節EMT尚不明了。

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