RET原癌基因C634R突變合并G691S、R982C多態性致多發內分泌腺瘤病2A型的家系研究并文獻復習

陳平，楊國慶，谷偉軍，金楠，巴建明，母義明，竇京濤

多發內分泌腺瘤病2型(multiple endocrine neoplasia type 2，MEN2)是一種由基因突變引起的顯性遺傳病，臨床上比較罕見。MEN2有3個亞型，分別是MEN2A、家族性甲狀腺髓樣癌(familial medullary thyroid cancer，FMTC)和MEN2B。MEN2A的患者以甲狀腺髓樣癌(90%)、單側或雙側的嗜鉻細胞瘤(50%)、甲狀旁腺功能亢進(20%~30%)為特征，約占MEN2患者總數的75%。以往文獻報道MEN2的發病與RET原癌基因突變有關[1]，不同位點突變導致的疾病可表現出不同的特征，而我國MEN2A患者以634位外顯子突變為主[2]?，F就解放軍總醫院收治的1例MEN2A患者及其家系進行研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料收集 進行家系調查，繪制家系圖。收集先證者及家系中其他成員病史等相關資料。①實驗室檢查：血、尿、便常規，血生化，24h尿3-甲氧基4-羥基苦杏仁酸(VMA)測定，全血糖化血紅蛋白(HbA1c)測定，甲狀腺功能測定，性腺功能檢查，血清皮質醇及血清促腎上腺皮質激素(ACTH)節律測定，臥立位試驗，生長激素測定，血清類胰島素生長因子-I(IGF-I)測定，骨代謝檢查。②影像學檢查：胸部正位X線片，甲狀腺及腎上腺超聲，腎上腺MRI檢查。③術后病理結果。

1.2 研究方法 經知情同意，取先證者及其家系共11名成員外周抗凝血5ml，采用酚/氯仿抽提法提取人血白細胞基因組DNA進行測序。對先證者RET基因的所有20個外顯子進行PCR擴增。引物序列(表1)采用Primer Premier 5進行設計，由北京三博遠志生物技術公司合成。50μl反應體系，其中Taq聚合酶、dNTP由大連寶生物公司提供。每個外顯子的擴增反應根據引物退火溫度的不同采取不同的降落PCR(touchdown PCR)反應參數。對擴增后的產物行瓊脂糖凝膠電泳進行粗測后，送三博遠志公司進行測序。

表1 RET原癌基因外顯子引物序列及擴增片段長度Tab. 1 Primers used to amplify exons of the RET proto-oncogene and amplified fragment length

2 結 果

2.1 病例資料 先證者，男，35歲，因“陣發心悸、頭痛10年余，再發1年”于2012年2月12日收入解放軍總醫院內分泌科。患者10年前無明顯誘因出現陣發性心悸、頭痛，頭痛呈搏動性，每次持續1~2min或10min左右，休息可緩解。發作時測血壓升高，收縮壓達200mmHg以上，伴面色蒼白，偶有大汗、右上腹疼痛。在當地醫院行相關檢查后診斷為“右側腎上腺嗜鉻細胞瘤”，行“腹腔鏡腫瘤切除術”，術后病理報告“嗜鉻細胞瘤”。術后患者癥狀完全緩解，無類似發作。1年前患者再次出現陣發性心悸、頭痛，性質同前，運動時易誘發，每次持續10min左右，伴右側季肋區隱痛，未予特殊處理。1個月前于當地醫院就診，行MRI檢查示“雙側腎上腺及腎門多發占位，考慮嗜鉻細胞瘤可能”，超聲檢查發現“雙側甲狀腺實質性占位病變”。查24h尿VMA 154.3mg(正常值1~8mg/d，下同)，為進一步檢查及治療赴我院就診?；颊呷朐汉蟛檠⒛颉⒈愠Ｒ幬匆娒黠@異常；骨代謝示：骨鈣素30.49ng/ml(14~46ng/ml)、全段甲狀旁腺激素41.93pg/ml(15~65pg/ml)、維生素D 34.0ng/ml(20~32ng/ml)、總I型膠原氨基端延長肽89.93μg/L(20~76μg/L)、β-膠原降解產物0.661ng/ml(0.3~0.58ng/ml)；血生化示：鈣2.38mmol/L、無機磷1.40mmol/L、游離鈣1.21mmol/L，肝腎功能無異常。全血HbA1c6.2%，血清甲狀腺素(TT4)117.2nmol/L (55.34~160.88nmol/L)，血清三碘甲狀腺原氨酸(TT3) 1.64nmol/L(1.01~2.95nmol/L)，血清游離T4(FT4) 14.80pmol/L(10.42~24.32pmol/L)，血清游離T3(FT3) 4.45pmol/L(2.76~6.3pmol/L)，血清促甲狀腺激素(TSH) 4.48mU/L (0.35~5.5mU/L)。性激素測定示：血清睪酮15.55nmol/L(8.4~28.7nmol/L)、血清雌二醇168.76pmol/L(≤353.1pmol/L)、血清黃體生成激素4.13mU/ml(1.5~9.3mU/ml)、血清卵泡刺激素6.19U/L(1.4~18.1U/L)。0∶00am、8∶00am、4∶00pm血清ACTH分別為2.33、9.08、3.49pmol/L，0∶00am、8∶00am、4∶00pm皮質醇分別為65.4、290.0、219.9nmol/L，節律無異常。血清生長激素0.061μg/L，IGF-I 134ng/ml。臥立位試驗提示患者腎素-血管緊張素-醛固酮系統對體位變化有反應。胸部正位X線片未見異常。腎上腺超聲示雙側腎上腺區偏低回聲結節。甲狀腺超聲示甲狀腺多發結節。甲狀腺穿刺病理示左葉、右葉均含鈣化結節，穿刺組織內見浸潤性生長的小圓細胞，并有淀粉樣物質沉積，符合髓樣癌表現。免疫組化染色顯示，腫瘤細胞CgA(+)，Syn(+)，Calcitonin(+)，CD56(+)，Ki-67+(＜5%)，TG(－)，TTF-1(+)，CK(+)。行相關檢查后予以鹽酸酚芐明術前準備，后轉泌尿外科行后腹腔鏡下左腎上腺嗜鉻細胞瘤切除術，術后病理回報：“(左側)腎上腺嗜鉻細胞瘤，腫瘤大小8.5cm×5.5cm×3.0cm，腫瘤未累及包膜，局部疑似侵犯脈管，周圍可見少許腎上腺組織”。免疫組化：CgA(+)，Syn(+)，S-100(+)，CK(－)，Inhibin(－)，MelanA(－)。后又于我院普外科行“雙側甲狀腺癌根治術+右頸前淋巴結清掃術”，術后病理回報：“左葉及峽部，右葉及峽部甲狀腺髓樣癌”。術后甲狀腺及腎上腺腫物組織HE染色切片見圖1。

圖1 先證者甲狀腺及腎上腺腫物組織切片(HE染色)Fig. 1 Tumors pathologic specimens of the proband's thyroid gland and adrenal gland (HE staining)

圖2 多發內分泌腺瘤病2A型患者家系圖Fig. 2 Pedigree of the investigated MEN2A family↗∶ The proband; □∶ Normal male; ○∶ Normal female; ∶ Male patient; ●∶ Female patient

對患者及其他10位親屬進行基因篩查，家系圖見圖2。此家系中先證者35歲，同時患有雙側腎上腺嗜鉻細胞瘤及甲狀腺髓樣癌，血鈣、磷及全段甲狀旁腺激素指標正常，超聲檢查未發現甲狀旁腺增生及腺瘤表現。家系成員Ⅱ-3于35歲時被診斷為腎上腺嗜鉻細胞瘤，目前37歲，行甲狀腺超聲未見占位表現。家族成員Ⅰ-2在約42歲時因“甲狀腺腫瘤”曾于當地醫院先后行4次手術治療，術后病理不詳，目前62歲，無嗜鉻細胞瘤表現。

2.2 基因測序分析 先證者(Ⅱ-5)及其他2位家系成員(Ⅰ-2、Ⅱ-3)存在如下3個位點的錯義突變：①RET基因第634密碼子TGC＞CGC突變，致其編碼的半胱氨酸變為精氨酸；②第691密碼子GGT＞AGT突變，致其編碼的甘氨酸變為絲氨酸；③第982密碼子CGC＞TGC突變，致其編碼的精氨酸變為半胱氨酸。其余家系成員均不存在以上突變。基因測序結果如圖3所示。

3 討 論

RET原癌基因位于10號染色體長臂(10q11.2)，含20個外顯子，于1985年被首次發現。1993年與1994年均有文獻證實MEN2A、FMTC和MEN2B由RET基因的胚系突變引起[1,3-4]。RET基因編碼一種跨膜的酪氨酸激酶受體，由胞膜外配體結合區、跨膜區和胞內酪氨酸激酶功能區組成。RET蛋白的胞外區與其他酪氨酸激酶受體不具有同源性，可分為半胱氨酸富集區和鈣黏著蛋白樣配基結合區。RET原癌基因所編碼的RET蛋白對人的腸神經和其他一些自主神經的發育以及腎臟發育、精子形成等都具有重要作用。基因突變所導致的RET功能失活可導致先天性巨結腸病、先天性中樞性低通氣綜合征、先天性腎及輸尿管發育不全(congenital anomalies of the kidney or urinary tract，CAKUT)等疾病，而RET蛋白功能異常激活可導致MEN2。

圖3 RET基因野生型(左)與MEN2A家系先證者突變型(右)測序圖Fig. 3 Sequencing results of the wild type RET gene (left)and mutant (right) of the proband with MEN2A

文獻報道的可導致MEN2A發病的常見胚系錯義突變位于10號外顯子(609、611、618和620密碼子)和11號外顯子(630密碼子及634密碼子)，這些密碼子參與編碼胞外富半胱氨酸區。MEN2A有85%的病例涉及第634密碼子的突變，其中最多的為C634R[5]。2001年歐洲MEN指南建議對MEN2患者及其家屬應從RET基因第10、11、13、14、15、16外顯子開始進行篩查，如未發現突變則對余下的外顯子進行篩查[6]。

本研究對患者RET基因的所有外顯子進行了測序，共發現3處錯義突變。其中C634R突變是MEN2A最常見的突變(85%的MEN2A涉及634密碼子突變，其中52%為C634R)。周瑜琳等[2]曾對我國15個MEN2A家系進行基因分析，發現被研究的所有MEN2A患者RET原癌基因突變均位于第634位密碼子。姚斌等[7]曾在一個MEN2A家系的患者中檢出RET原癌基因DelD631雜合缺失突變；張少玲等[8]曾在一個MEN2A家系患者外周血DNA中檢出RET原癌基因1893－1895DelCGA雜合缺失突變。我國目前已報道的可致MEN2A的RET基因突變以634位密碼子的突變為主，較國外單一。634位密碼子所編碼的半胱氨酸位于胞外的半胱氨酸富集區，突變導致半胱氨酸殘基變為非半胱氨酸殘基，與半胱氨酸殘基的RET蛋白單體形成分子間二硫鍵，產生畸變的二聚體，使胞內的酪氨酸激酶被異?；罨?，導致促絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)激活增強并降低p18、p27水平，從而導致細胞異常增殖[9]。

早在1994年即有研究認為G691S是一種單核苷酸多態性(SNP)位點[10-12]。Bounacer等[10]曾經報道，輻射誘導的甲狀腺上皮腫瘤患者中G691S多態性的檢出率高于甲狀腺散發腫瘤及正常甲狀腺，而輻射誘導的甲狀腺腫瘤伴C細胞增生的患者中有88%與G691S相關。Elisei等[13]曾對106例散發的甲狀腺髓樣癌患者與106位年齡、性別、種族、地區匹配的對照人群RET基因的4個多態性位點進行對比分析，發現G691S多態性在甲狀腺髓樣癌患者組中檢出的概率(27.83%)要明顯高于對照組(18.86%，P=0.029)，而其他3個多態性差異無統計學意義，從而推斷G691S多態性具有遺傳修飾作用。Borrello等[14]通過實驗證實G691S增強了K666E的轉化活性，并認為G691S是一種有功能的多態性并起著調控作用。

Chatterjee等[15]對122例CAKUT患者進行基因分析，發現1例13歲的男性患兒繼承了來自其健康父親的RET基因G691S、R982C雙突變和健康母親的GFRa1基因G443D突變，導致其發生了CAKUT(患者表現為腎臟發育不全、腎臟結構異常、腎臟異位、巨輸尿管和膀胱輸尿管反流等)，后又通過蛋白印跡法對其致病機制進行研究，發現G691S或者R982C突變單獨存在時不會影響MAPK(RET蛋白下行信號的效應器)活性，而當G691S、R982C突變同時存在時，膠質細胞源性神經營養因子(glial cellderived neurotrophic factor ，GDNF)依賴的MAPK磷酸化作用幾乎完全喪失。

根據以往研究報道，C634R突變會導致RET蛋白形成畸變的二聚體，從而引起下行信號傳導通路的異常激活，G691S、R982C雙突變同時存在可導致下行信號傳導通路一定程度上的失活。而本研究家系中的3位患者同時存在以上3個位點的突變，臨床上表現為甲狀腺髓樣癌和嗜鉻細胞瘤，為典型的MEN2A表現，不存在先天性巨結腸病、先天性低通氣綜合征、CAKUT等RET蛋白失功能性疾病，在腫瘤發生的類型和年齡上與以往報道的單純C634R突變患者無明顯差異，提示當C634R、G691S、R982C突變同時存在時，對RET蛋白功能的影響仍然以C634R突變所致的異常激活為主，從而導致MEN2A的發生。

綜上所述，對MEN2患者及其親屬進行基因篩查可以從基因水平做出診斷，同時可發現家系中潛在的患者并在適當時間段采取干預措施。根據2009年ATA發表的指南所推薦的干預措施，存在C634R突變屬C級風險，攜帶此突變的患者應于5歲前行甲狀腺切除術并進行終生替代治療，8歲開始篩查嗜鉻細胞瘤和甲狀旁腺功能亢進癥[5]。本家系中患者Ⅱ-3及Ⅱ-5共育有4個子女，經基因篩查發現4位子女無一人繼承其父輩的致病突變?；颊撷?3至今39歲，仍未有甲狀腺髓樣癌表現，在向患者介紹疾病相關知識后建議其行甲狀腺切除術并替代治療。

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