旋轉式生物反應器內構建組織工程椎間盤

張文捷，張 亮，趙春明，張 威 (江蘇省泰州市人民醫院骨科，江蘇 泰州 225300)

椎間盤退變性病變現階段臨床常常會使用到的治療方法是保守或是手術融合相關節段，但是都會不同程度地忽略椎間盤功能的重建。生物反應器能模擬體內生物環境，是組織工程的理想培養系統。筆者探討旋轉式生物反應器(RCCS)對體外構建的組織工程髓核的影響。

1 材料與方法

1.1 材料:新西蘭兔(南京金陵種兔場)，培養基DMEM/F－12 (美國Gibco公司)，胎牛血清(美國Hyclone公司)，Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶、多聚賴氨酸、抗壞血酸(美Sigma公司)，Ⅱ型膠原多克隆抗體SABC、DAB試劑盒(武漢博士德公司)，PLGA無紡網支架(上海易括公司)，旋轉式生物反應器(美國Synthecon公司)。

1.2 方法

1.2.1 髓核細胞的分離:無菌條件下取出1個月新西蘭兔髓核組織，將其剪成1mm大小，經0.25%胰酶消化后加胎牛血清中和，離心去上清，PBS洗滌。加入0.2%的Ⅱ型膠原酶消化4 h，濾液經1 500 r/min離心5 min，棄上清，PBS清洗再次離心，白色沉淀中加入含15%胎牛血清的DMEM/F－12培養基，調整細胞密度，以5×104/ml密度接種于培養瓶中培養。每2～3天換液1次，當細胞80%融合后，胰酶消化傳代，取第3代細胞備用。

1.2.2 細胞接種支架及實驗分組:PLGA無紡網支架材料，將支架切成5 mm×5mm大小，浸入10 g/L多聚賴氨酸中，完全浸透后取出，自然干燥后，無菌PBS沖洗3遍，放入90mm無菌培養皿中干燥，環氧乙烷消毒后備用。取第3代髓核細胞，調整細胞濃度為3×107/ml，每個支架中滴加40μl細胞懸液，置于6孔培養板內，放入細胞培養箱內培養。培養72 h后，進行實驗分組。實驗分兩組:6塊髓核細胞與支架復合物為治療組，移入RCCS內，調整轉速至細胞與支架復合物處于半懸浮狀態，約20 r/min，以后隨著復合物的變化調整轉速。另6塊髓核細胞與支架復合物為對照組，在六孔板內靜態培養。兩組均隔天換液1次。

1.2.3 大體標本和組織學觀察:4周后將復合物順利取出，對組織工程髓核的形態、大小、厚度和彈性所發生的變化進行詳細的觀察;組織學觀察:標本行HE染色和Ⅱ型膠原免疫組織化學染色(SABC法DAB顯色)，用Image Proplus軟件對Ⅱ膠原免疫組化染色切片行半定量圖像分析。

2 結果

2.1 大體標本觀察:治療組形成的髓核組織表面光滑，體積較大，厚度較厚，呈傘型，具有一定彈性及抗壓能力。對照組髓核組織表面欠光整，體積較小，厚度薄，彈性差，見圖1～2。

2.2 HE染色組織學觀察:HE染色發現，治療組細胞數目較多，均勻連續分布，組織具有一定的排列結構。對照組細胞數目少，細胞間排列稀疏，分布不均勻，組織排列紊亂。

2.3 免疫組織化學觀察:治療組與對照組免疫組織化學結果比較表明，治療組染色程度深，染色面積大。治療組陽性染色面積為(15.0±4.6)%，對照組為(6.5±2.2)%，兩組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。

3 討論

椎間盤退變將引起其他一系列脊柱退行性疾病，理想的治療方案是重建椎間盤的組織功能。組織工程學的發展，為治療椎間盤退變引入了新的方法［1］。

椎間盤在體內處于復雜的應力環境，具有良好的生物力學強度對于其維持正常功能具有重要意義。椎間盤組織的力學強度主要由其細胞外基質所維持，髓核細胞主要表達Ⅱ型膠原及蛋白多糖，Ⅱ型膠原承受壓力，蛋白多糖承受張力。常規體外條件下構建的組織工程椎間盤只能達到外形上的相似，在細胞外基質上難以達到正常椎間盤組織的要求［2］。分析其原因，可能為在普通培養中細胞承受重力、減切力等不利影響，難以模擬體內所處的失重環境，支架中心的細胞營養物質的缺乏，從而影響細胞增殖及細胞外基質合成。

生物反應器的發展為組織工程帶來新的希望，目前在骨及軟骨組織工程中生物反應器已有較廣泛應用，通過其構建的組織更接近于活體。本實驗所采用的旋轉式生物反應器，能為構建的組織工程髓核提供了低剪切力及微重力的有利環境。本實驗中通過調整轉速至細胞與支架復合物處于半懸浮狀態，約20 r/min，使得細胞與支架復合體作為一個整體相互間無相對運動，他們不與容器壁或任何其他易致損傷的物體相碰，剪切力趨于零，細胞不易受到機械損傷，易于保持活性，有利于細胞在支架上均勻分布，促進營養成分和氧氣運送至支架中心，保證支架中央細胞的代謝需要，使得培養組織不易形成“壞死中心”，從而促進細胞增殖及基質分泌。

本研究表明，旋轉式生物反應器能夠提供低剪切力及微重力的培養環境，能促進髓核細胞增殖和細胞外基質分泌，為解決普通條件下的組織工程髓核中細胞外基質成分少的難題提供了可能，為組織工程髓核應用于臨床創造了有利條件。

［1］ Mehrkens A，Muller AM，Valderrabano V，etal.Tissue engineering approaches to degenerative disc disease－ameta－analysis of controlled animal trials［J］.Osteoarthritis Cartilage，2012，20(11):1316.

［2］ 張 亮，任永信，葛 靈，張 寧.離心應力下構建組織工程髓核［J］.南京醫科大學學報(自然科學版)，2008，28(06):707.