杜仲綠原酸生物合成途徑相關基因的差異表達

李鐵柱，杜紅巖，朱高浦

（1.中國林業科學研究院 經濟林研究開發中心，河南 鄭州 450003；2.國家林業局 杜仲工程技術研究中心，河南 鄭州 450003）

杜仲Eucommia ulmoidesOliv.是我國特有名貴藥用樹種[1]，果實、葉片、樹皮、雄蕊中含有苯丙素類、不飽和脂肪酸、黃酮類、環烯醚萜類、木質素類等活性成分，具有明顯的補肝腎、強筋骨、安胎作用、抗菌消炎、降血壓降血脂等作用，廣泛應用于醫藥保健、食品和化妝品行業[2]。杜仲葉片中的主要苯丙素類物質是綠原酸（Chlorogenic acid）[3-7]。杜仲綠原酸抗菌作用較強，具有降壓、抗菌、消炎、止血、抗氧化等作用，對急性咽喉炎及皮膚病有明顯療效[8]。

綠原酸（Chlorogenic acid）是由咖啡酸（Caffeic acid）與奎尼酸（Quinic acid，QA）組成的縮酚酸[9-10]，異名咖啡單寧酸，又咖啡鞣酸，化學名為5-O-咖啡酰奎尼酸（5-O-caffeoylqulnic acid），分子式為C16H18O9，相對分子質量為354.30。它是植物在有氧呼吸過程中經磷酸戊糖途徑中間產物合成的一種苯丙素類物質[11]。綠原酸生物合成途徑見圖1。

圖1 綠原酸合成途徑Fig.1 The pathway of chlorogenic acid biosynthesis

咖啡酰基在奎尼酸上的結合部位和數目有所不同，從理論上講，單咖啡酰奎尼酸和二咖啡酰奎尼酸所行形成的綠原酸共有10種異構體，但到目前為止，從植物中發現的綠原酸異構體有7種，即綠原酸（5-O-咖啡酰奎尼酸）、隱綠原酸（4-咖啡酰奎尼酸）、新綠原酸（3-咖啡酰奎尼酸）、異綠原酸A（4,5-二咖啡酰奎尼酸）、異綠原酸B（3,5-二咖啡酰奎尼酸）、異綠原酸C（3,4-二咖啡酰奎尼酸）、萊薊素（l,3-二咖啡酰奎尼酸）。

1 材料與方法

分別于2010年5月28日和10月28日，在國家林業局泡桐研究開發中心采集“華仲6號”杜仲優良品種葉片和果實，提取RNA，送至深圳華大基因公司進行轉錄組測序和基因功能注釋[12-13]。

轉錄組測序得到的Unigene，利用NCBI網站上的BLAST工具，和其它物種已知的CDS序列進行在線比較，用相似性得分比較高的已知基因確定并命名杜仲轉錄組中的待分析基因。確定基因后，分析該基因（或基因家族）在杜仲葉片和果實中的表達量，推斷該基因在杜仲活性成分生物合成中的地位和作用。

2 結果與分析

2.1 杜仲轉錄組中綠原酸生物合成途徑中被注釋的Unigene基因

在杜仲葉片和果實轉錄組數據中共3個步驟、4個基因被KEGG數據庫綠原酸合成途徑注釋（見圖2）。苯丙氨酸脫氨酶（phenylalanin ammonia-lyase，PAL）注釋Unigene9151等3條Unigene，其中果實和葉片差異表達的基因有1條；肉桂酸-4-羥化酶（cinnamate 4-hydroxylase，C4H）注釋Unigene9197等9條Unigene，其中差異表達基因有4條；香豆酸-CoA連接酶（4CL）注釋Unigene6686等24條Unigene，其中差異表達基因有13條；莽草酸羥基肉桂酰轉移酶（shikimate hydroxycinnamoyl transferase，HCT） 注 釋Unigene24848等43條Unigene，其中差異表達基因有20條。

2.2 杜仲葉片和果實綠原酸合成途徑系列基因的確定

經過進一步BLAST分析發現，Unigene9151、Unigene3306、Unigene8123等13條Unigene與長春花、咖啡等植物種的PAL基因相似性達到77%～99%（見表1）。其中Unigene9151為PAL基因全長cDNA；Unigene9197、Unigene27913等2條Unigene與煙草等植物種的肉桂酸-4-羥化酶相似性達到77%～90%，為C4H基因全長cDNA；Unigene6686、Unigene14128等11條Unigene與楊樹、白樺等植物種的4CL基因相似性達到66%～92%；Unigene24848、Unigene6511與咖啡等植物種的HCT基因相似性分別達到56%和54%，其中Unigene24848為全長cDNA。

2.3 杜仲綠原酸相關基因多樣性及表達差異

2.3.1 杜仲EuPAL基因的多樣性及表達差異

苯丙氨酸脫氫酶（PAL）是綠原酸合成途徑中的關鍵酶[14-15]，杜仲的果實和葉片組織中PAL的多態性非常高，PAL基因家族高達至少12個成員，分別命名為EuPAL1～EuPAL12，其中Unigene9151即EuPAL1為全長cDNA（見表2）。

杜仲果實和葉片的轉錄組分析表明，杜仲苯丙氨酸脫氫酶EuPAL1～EuPAL12（Unigene15537～Unigene81458）12個基因在葉片和果實中均有表達，但EuPAL3～EuPAL12（Unigene15537～Unigene8123）的表達量存在顯著差異（見表3）。其中表達量最高的EuPAL3（Unigene46841）和 最 低 的EuPAL12（Unigene38418）在果實的表達量分別比葉片高29.22倍和19.02倍（見圖3），而EuPAL1（Unigene9151） 和EuPAL12（Unigene18458），在果實和葉片的表達量未達到顯著水平。

圖2 KEGG數據庫中的綠原酸生物合成Fig.2 The KEGG pathway of chlorogenic acid biosynthesis

表1 綠原酸合成途徑中相關酶基因和對應Unigene相似度信息Table 1 Information of similarity between gene and Unigene in chlorogenic acid synthesis pathway

表2 杜仲葉片和果實EuPAL基因多樣性Table 2 Genetic diversity of EuPAL

表3 苯丙氨酸脫氫酶相關基因在杜仲葉片和果實中的表達多樣性Table 3 Expression of Unigene related in EuPAL in leaves and young fruits

圖3 苯丙氨酸脫氫酶相關Unigene在杜仲葉片和果實中的表達差異Fig.3 Expression difference of related EuPAL Unigene related in leaf and fruit

葉片的PAL基因的表達量最高為EuPAL1（Unigene9151），其次為EuPAL12（Unigene81458），推測杜仲葉片中綠原酸合成的主要的苯丙氨酸脫氫酶為EuPAL1和EuPAL2。果實PAL基因按照表達量由大到小的順序排列依次為EuPAL3、EuPAL4、EuPAL5、EuPAL6、EuPAL7、EuPAL8、EuPAL9、EuPAL10、EuPAL11、EuPAL1、EuPAL12、EuPAL2。杜仲葉片以EuPAL1和EuPAL2為主，而果實中PAL基因的遺傳多樣性比葉子高很多，基因表達量也高很多，表達調控模式極其復雜。

2.3.2 EuC4H基因的多樣性和表達差異

肉桂酸-4-羥化酶（C4H）基因拷貝數在不同植物種是不同的，如苜蓿有2個，豌豆有1個，綠豆和長春花中多個拷貝的小基因家族形式存在[15-17]。從表4可以看出，杜仲的果實和葉片組織中獲得2個全長C4H基因（Unigene9197和Unigene27913），分別命名為EuC4H1和EuC4H2。

表4 杜仲肉桂酸-4-羥化酶基因的多樣性Table 4 Diversity of EuC4H genes

歐芹種子C4H表達模式研究結果顯示，該酶在微管束發達的花梗中表達豐富，在幼葉和老葉中不表達，擬南芥種C4H基因于正在木質化的細胞中表達最強[18-19]。杜仲的果實和葉片中EuC4H1（Unigene9197）和EuC4H2（Unigene27913）基因均有表達，且表達量存在著顯著差異（見表5），EuC4H1和EuC4H2在果實中的表達量分別比葉片高出105.25倍和6.32倍（見圖4）。葉片中EuC4H1的表達量較高，但EuC4H2表達量接近零，推測葉片綠原酸合成途徑中主要起作用的是EuC4H1基因。無論在果實還是在葉片中EuC4H1的表達量均比EuC4H2高，故果實也以EuC4H1為主。

表5 EuC4H基因在杜仲葉片和果實中的表達多樣性Table 5 Expression diversity of EuC4H in leaf and fruit

圖4 EuC4H基因在杜仲葉片和果實中的表達差異Fig.4 Expression difference of EuC4H in leaf and fruit

2.3.3 Eu4CL基因的多樣性及表達差異

擬南芥中4CL基因家族有4個成員，煙草有2個成員，大豆有4個成員，顫楊有2個成員，復盆子有3個成員[20-22]。杜仲的果實和葉片中獲得了11個4CL家族成員，分別命名為Eu4CL1～Eu4CL11（見表6）。

11個杜仲香豆酰-CoA連接酶中Eu4CL2（Unigene14857）、Eu4CL3（Unigene6686）、Eu4CL7（Unigene18613）等3個Eu4CL基因在果實和葉片的表達未達到顯著差異（見表7）；而Eu4CL1（Unigene14128）、Eu4CL4（Unigene48688）、Eu4CL5（Unigene29944）、Eu4CL6（Unigene45667）、Eu4CL8（Unigene28080） 等 5個Eu4CL在 果 實和葉片中的表達具有顯著差異，而且在幼果中均比葉片中表達量高，表達量最大的Eu4CL4基因比葉片高出35.04倍（見表7和圖5）；Eu4CL9（Unigene40135）、Eu4CL10（Unigene23597）、Eu4CL11（Unigene22350）在果實中特異表達，但表達量較低。按照Eu4CL在果實中表達量由大到小的順序排列依次為：Eu4CL4、Eu4CL6、Eu4CL5、Eu4CL1、Eu4CL2、Eu4CL3、Eu4CL7、Eu4CL8、Eu4CL11、Eu4CL9、Eu4CL10； 按 照Eu4CL在葉片中表達量由大到小的順序排列依次 為：Eu4CL2、Eu4CL3、Eu4CL6、Eu4CL4、Eu4CL5、Eu4CL1、Eu4CL7、Eu4CL8。幼果和葉片中Eu4CL～Eu4CL6等基因大量表達，表達調控規律極其復雜。

表6 杜仲4CL基因多樣性Table 6 Diversity of Eu4CL genes

表7 香豆酰-CoA連接酶相關Unigene在杜仲葉片和果實中的表達多樣性Table 7 Expression diversity of related Eu4CL Unigene in leaf and fruit

圖5 香豆酰-CoA連接酶相關Unigene在杜仲葉片和果實中的表達差異Fig.5 Expression difference of related Eu4CL Unigene in leaf and fruit

2.3.4 EuHCT基因的多樣性和表達差異

莽草酸羥基肉桂酸酰轉移酶是綠原酸合成途徑中的限速酶[23-24]。杜仲轉錄組數據中獲得了3個莽草酸羥基肉桂酸酰轉移酶基因家族3個成員，分別命名為EuHCT1～EuHCT3（見表8）。

3個EuHCT基因家族成員在葉片和果實中均有表達，但僅有EuHCT1在果實和葉片中表達量有顯著差異，且在果實中的表達量比葉片高出25.44倍（見表9和圖6）；而EuHCT2和EuHCT3在果實和葉片中的表達量無顯著差異。按照在果實中表達量由大到小的順序排列依次為EuHCT1、EuHCT2、EuHCT3； 按 照 葉 片 中的表達量由大到小的順序排列依次為EuHCT2、EuHCT1、EuHCT3。杜仲幼果以EuHCT1、葉片以EuHCT2為主。

表8 杜仲莽草酸羥基肉桂酸酰轉移酶基因多樣性Table 8 Diversity of EuHCT genes

表9 莽草酸羥基肉桂酸酰轉移酶相關Unigene在杜仲葉片和果實中的表達量Table 9 Expression of related HCT Unigene in leaf and fruit

3 結論與討論

杜仲苯丙素類物質廣泛存在于杜仲根皮、莖皮、綠葉、果實中,包括綠原酸、咖啡酸、松柏酸、松柏苷、丁香苷、香草酸等11種化合物。本研究中發現的各相關基因及基因家族，其中哪些基因家族成員專營合成綠原酸，或者哪些基因在綠原酸合成中起最關鍵作用，這些問題都有待進一步分析。

苯丙氨酸解氨酶是杜仲綠原酸合成途徑中的上游的關鍵酶，本研究從杜仲葉片和果實的轉錄組中發現了12個PAL基因，說明杜仲該基因的遺傳多樣性非常高，超過一般植物。杜仲器官組織中的綠原酸含量，還隨著時間季節的變化而變化[25]，本研究采集的樣品是5月份和10月份的，杜仲PAL基因及其它基因是否也有時間上的多態性。

另外，在不同的杜仲品種之間，綠原酸等活性成分含量也不一樣[26]，在其它品種中，PAL等基因的表達規律是否和“華仲6號”一致還有待進一步探討。不同栽培模式對杜仲葉片及枝、皮等器官中的活性成分的含量也有較大影響[27]，從分子層次來看，是否對PAL等基因的表達調控也會造成影響，還需要進一步分析。

圖6 HCT相關Unigene在杜仲葉片和果實中的表達差異Fig.6 Expression difference of related HCT Unigene in leaf and fruit

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