臍血間充質干細胞對一氧化碳中毒遲發型腦病治療的研究進展

蘆 倩 宮殿榮

(1.泰山醫學院，山東泰安 271016;2.泰山醫學院附屬聊城醫院神經內科，山東聊城 252000)

間充質干細胞(mesenechymal steme cell，MSC)是來源于中胚層發育的早期細胞，具有全能干細胞的特點，能夠多向分化，在適合的條件下可分化為多種細胞，尤其可誘導分化為神經樣細胞，表達神經干細胞特異性抗原標志nestin及神經細胞和膠質細胞的特異性抗原標志，甚至出現神經細胞樣電活動［2］。臍血作為MSC的來源之一具有含量較豐富，易于采集與保存，且不存在倫理問題，與骨髓相比，MSCs具有來源充足免疫原性更弱等優點，預示臍血比骨髓間質干細胞有更廣闊的應用前景。應用臍血間充質干細胞治療一氧化碳中毒遲發型腦病(DEACMP)較傳統方法有很多優點，如低毒性或無毒性，長期有效;下面就臍血間充質干細胞移植治療DEACMP研究進展進行綜述。

1 MSC的起源及定義

1976年，在骨髓培養過程中，Friedenstein等首次發現了一種呈梭形并有突起的貼壁細胞，可分化為類似骨或軟骨的集落，隨后發現，此類細胞有多向分化的潛能，在特定條件下甚至可以定向誘導分化為神經元及膠質細胞，這種骨髓起源的間質干細胞命名為骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenechymal steme cell，BMMsC)。后來，研究者又在胎肺、胎腎、外周血、臍帶等多個部位分離出這種具有貼壁能力、梭形、能夠多次傳代、多向分化潛能的干細胞，與BMMSC具有相似的生物學特性，也屬于MSC。

2 臍血間充質干細胞

2000年，Erices 8首先報道了從臍血中分離出成纖維細胞樣細胞，能夠表達細胞表面抗原SHZ、SH3、SH4、ASMA、MAB1470、CD13、CD29 和 CD49e，與骨髓來源MSC相同，他認為這種細胞也屬于間充質干細胞。其后，陸續有研究小組報道從臍血單個核細胞中分離出貼壁細胞，這些細胞表達粘附分子CD13+、CD29+及CD44+，但不表達造血干細胞特異性抗原，其細胞形態、生長方式、生物學特性與骨髓來源MSC相似。研究同時發現，臍血的多能干細胞建系需時較長，前體細胞出現頻率明顯較骨髓低，骨性抗原表達水平低，無持續表達的神經抗原。提示該類前體細胞可能比骨髓MSC更原始。近年來的研究還發現，在一定條件下，臍血間充質干細胞(UCB-MSCs)在神經細胞誘導介質中經7～10 d的誘導，呈現神經細胞樣形態，可表達神經細胞的特異性表型，提示可用作神經前體細胞的替代來源［3］。可見，臍血間充質干細胞有更多生物學特性和功能有待我們去研究。而且，臍帶血存在于胎兒娩出、臍帶結扎并離斷后廢棄的胎盤和臍帶中，因此來源廣泛，不受倫理學等約束;另外，臍帶血干細胞具有人類白細胞抗原配型相合程度要求低、傳染病毒風險低、移植后嚴重排斥發生率較低等特性，這些都預示著臍血間充質干細胞將具有重要的臨床實用價值。

3 神經干細胞

Mckay于1997年正式提出了神經干細胞的概念:神經干細胞(neural stem cell，NSCs)是具有分化為神經元、星形膠質細胞及少突膠質細胞的能力，能自我更新，并足以提供大量腦組織細胞的細胞。1992年首次從成年小鼠腦紋狀體中分離出能在體外不斷分裂增殖，且具有多種分化潛能的細胞群。隨后的很多實驗發現側腦室壁的腦室下層(subven-tricular zone，SVZ)、海馬齒狀回顆粒下層(subgranular proliferative zone，SGZ)、室管膜區、大腦皮質、嗅球、紋狀體、間腦、小腦、脊髓和視網膜均分離到神經干細胞。神經干細胞具有以下特性:① 可生成神經組織或來源于神經系統;②在一定條件下能不斷進行有絲分裂，以滿足神經多樣性的需要;③多潛能分化，同時又能自我更新;④低免疫原性，神經細胞是未分化的原始細胞，不表達成熟細胞抗原，較少發生異體排異反應，有利于其存活。

4 臍血間充質干細胞治療一氧化碳中毒遲發型腦病

4.1 DEACMP目前研究進展

DEACMP是指急性一氧化碳中毒昏迷后，經過一段時間清醒(3～30 d)，再次出現意識障礙、精神癥狀、震顫等系列癥狀，主要表現為癡呆、定向力下降、行為異常、震顫、偏癱、頭疼、失眠、乏力、記憶力減退、大小便失禁等［4］。病理改變主要為大腦白質的廣泛髓鞘脫失，蒼白球出現對稱性軟化灶。目前DEACMP的發病機制尚未完全明確，近年來，人們一直進行各種探索，如缺血缺氧機制，細胞毒性損傷機制，再灌注損傷和自由基機制，興奮性氨基酸機制，免疫功能異常和神經遞質紊亂機制，神經凋亡機制等。目前臨床主要以改善腦循環、營養神經細胞，結合高壓氧及對癥治療為主，然而使用神經節苷脂、依達拉奉和多奈哌齊等藥物對DEACMP患者的預后無明顯影響［5］，高壓氧治療也僅能縮短CO的半排出期，促進排除CO，增加血液中的氧含量，改善組織修復環境，只在CO中毒急性期作用顯著，對DEACMP治療只起輔助作用［6］。近年來，不少研究表明，CO中毒后期持續使用HBO治療CO中毒，以及使用HBO治療遲發性腦病，理論依據均不足［7］，更有研究指出長期HBO能導致氧中毒，加重病情進展。干細胞的出現無疑為DEACMP的治療開辟了新空間。

4.2 神經干細胞在治療DEACMP中的作用

研究發現腦損傷時神經干細胞能被激活，發生增殖、遷徙并分化［8］。SVZ的干細胞沿嘴側遷移路徑(rostral migratory stream，RMS)遷移至嗅球，分化發育成新的中間神經元并進一步建立起神經連接;SGZ的干細胞則發育形成另一種不同類型的神經元-顆粒細胞，并與海馬齒狀回建立突觸聯系。腦組織損傷、缺血、生長因子等引起了腦內某些因子變化，通過不同途徑作用于神經干細胞，誘導內源性NSCs增殖、分化和遷移，增殖分化的神經元部分代替和修復受損的神經元，對損傷產生可塑性反應。而腦損傷后僅調動內源性神經干細胞自我修復是有限的，不僅神經干細胞的數量不足，而且某些調節遷移、分化、存活、神經元修復和突觸形成的因子也不足，導致自體干細胞其修復能力有限。然而臨床中樞神經系統疾患病例中，原位神經干細胞在中樞神經系統疾病發生過程中，并未發揮自我修復作用。其可能原因有:①原位誘導出功能特異的神經元可能需要多種刺激和特定細胞因子的作用。②患者中樞神經系統的干細胞缺陷或無法激活。因此神經干細胞的發現和體外培養成功及移植治療，為中樞神經系統病的細胞替代療法拓寬了道路。雖然如上所述神經系統疾病細胞替代治療最理想的種子細胞是神經干細胞，但神經干細胞取材困難，特別是胎腦的來源有限，還受到倫理和法律的束縛，限制了其臨床的應用。

4.3 臍血間充質干細胞治療DEACMP的研究

4.3.1 移植途徑和方法

UCB-MSCs移植的途徑有:通過腦立體定位儀將UCB-MSCs注入側腦室、紋狀體、海馬等;直接注射入腦室或蛛網膜下腔，通過腦脊液的流動將細胞帶到病變部位;注射入靜脈或動脈，使其通過血腦屏障到達病變部位，主要應用于鼠尾靜脈注射。UCB-MSCs移植治DEACMP的方法主要有:一是將未誘導或修飾過的UCB-MSCs直接移植入體內，利用體內環境的信號誘導分化為合適的細胞。另外一種方法是移植經過誘導或因修飾過的UCB-MSCs，使其分化為所需要的神經細胞后再移植入體內。

4.3.2 移植的影響因素

UCB-MSCs的選取、分離培養方法，分化為神經細胞的效率，移植細胞的類型、數量、合適的比例、合適的移植位點，UCB-MSCs對細胞外環境的影響以及細胞外環境對UCB-MSCs的影響，腦中內源性因子的作用以及UCB-MSCs在腦內存活時間對移植療效均有一定的影響。Karen等發現，UCB-MSCs分離較為合適的條件是，樣本保存時間不超過15 h，樣本中血液體積要超過33 ml，并且血液中沒有血凝塊和胰酶，單份血液中的 MSC要超過 108。Buzanska等將貼壁后的UCB-MSCs在含EGF培養基中培養6周，獲得nestin陽性的細胞集落，隨后將這種細胞分別用多聚左旋賴氨酸、視黃酸和BDNF誘導，可分化為神經元、神經膠質細胞和少突膠質細胞;若與大鼠腦原代培養單層細胞共培養，也可獲得神經元和神經膠質細胞。

4.3.3 UCB-MSCs治療DEACMP的可能機制

①UCB-MSCs本身所具有復雜精細的控制系統，可以防止蛋白質的錯構和聚集，如分子伴侶促進適當的蛋白質折疊，防止非天然的蛋白質聚集［9］。醫療控制可以使處于錯構的蛋白質被泛素蛋白酶小體系統以及吞噬體溶酶體系統降解，尤以泛素蛋白酶小體系統重要，從而阻止疾病病程的進展［10-11］。②UCB-MSCs可以定位包繞在病變組織的周圍，并形成網絡修復壞損的神經組織，使患者能夠恢復喪失的神經功能［12］。③UCB-MSCs在中樞神經系統微環境下能分泌腦源性神經營養因子、堿性成纖維生長因子等營養因子，或者刺激損傷部位產生內源性因子，促進損傷組織的修復并減少細胞凋亡。④UCB-MSCs移植入腦后，能形成表達神經標志性蛋白的神經元樣細胞或星形膠質細胞，產生的細胞可在受損部位周圍存活甚至移行至全腦［13］。⑤UCBMSCs可分化成血管內皮細胞和細胞外基質，幫助神經保護、促進血管發生［14］。⑥UCB-MSCs可以分泌多種神經營養因子以營養激活內源性神經干細胞，并誘導分化成神經組織細胞替代缺損細胞，即啟動內源性途徑修復損傷。⑦在腦內創造適宜的局部微環境，通過體外擴增或不同因子誘導分化的方法使UCB-MSCs分化為神經細胞后進行移植，替代受損細胞重建神經功能區和傳導通路［15］。近年有研究表明，UCB-MSCs可以改善患者的自主神經、小腦錐體外系和運動癥狀［16-17］。因此，其在DEACMP的臨床應用必將得到推廣。

5 展望

臍血間充質干細胞因其來源豐富、采集方便、具備自我更新、多向分化的能力，在特定的誘導條件下可向其他組織分化，移植后免疫排斥反應低等特點備受大家關注。目前，臨床上已用于治療脊髓損傷［18］、多系統萎縮［19］、帕金森氏病［20］、腦癱患兒［21］等神經系統疾病，并取得了顯著療效，為廣大患者帶來了希望。然而其分離、培養及鑒定還有許多工作要做，臍血間充質干細胞的誘導、分化及遷移機制有待研究，移植的最佳時間窗仍有待于解決，臍血間充質干細胞移植的療效及安全也需進一步評定，但相信隨著科學技術的發展，上述存在的問題將逐步解決，臍血間充質干細胞的應用將有廣闊的前景。

［1］ 宮殿榮，吳曙暉，于海燕.干細胞移植成功治療一氧化碳中毒遲發性腦病一例［J］.中國全科醫學，2011，10(14)：3403.

［2］ 楊樹源，張文治.大鼠骨髓間允質干細胞體外誘導向神經元分化［J］.中華神經外科雜志，2005，21(1)：55-58.

［3］ 萬超，李剛，秦泗河.國際細胞治療學會第十次年會紀要［J］.中國矯形外科雜志，2006，14(4)：311-314.

［4］ 韓培海，高思山，楊琴，等.急性一氧化碳中毒后遲發型腦病的相關因素分析［J］.中風與神經疾病雜志，2009，26(1)：100-101.

［5］ 王寅旭，王曉明，陳芳.急性一氧化碳中毒后遲發性腦病的預后因素分析［J］.中華腦血管病雜志：電子版，2011，5(6)：499.

［6］ 孫玉芹.急性CO中毒遲發腦病臨床觀察［J］.中國社區醫師，2007，9(177)：125.

［7］ Gill AI，Bell CN.A hyperbaric oxygen：it＇s uses，mechanismsof act ion and out com es［J］.Q J Med，2004，97(7) ：385-395.

［8］ Iwai M，Sato K，Kamada H，et al.Temporal profile of stem cell division，migrantion，and differentiation from subventricular zone to olfactory bulb after transient forebrain ischemia in gerbils［J］.J Cebeb Blood Flow Metab，2003，23(3)：334-341.

［9］ Kan I，Melamed E，Offen D.Autotransplantation of bone marrowderived stem cells as a therapy for neurodegenerative diseases［J］.Handb Exp Pharmacol，2007，180：219-242.

［10］ Mathias CJ.Multiple system atrophy and autonomic failure［J］.JNeural Transm Suppl，2006，70：343-347.

［11］ Colosimo C，Tiple D，Wenning GK.Management of multiplesystem atrophy：state of the art［J］.J Neural Transm，2005，112(12)：1695-1704.

［12］ Crigler L，Robey RC，Asawachaicham A，et al.Human mesenchymal stem cell subpopulations express a variety ofneuro-regulatory molecules and promote neuronal cell survivaland neuritogenesis［J］.Exp Neurol，2006，198(1)：54-64.

［13］ Jin GZ，Cho SJ，Choi EG，et al.Rat mesenchymal stem cells increase tyrosine hydroxylase expression and dopamine content inventral mesencephalic cells in vitro ［J］.Cell Biol Int，2008，32(11)：1433-1438.

［14］ Kim YJ，Park HJ，Lee G，et al.Neuroprotective effects of human mesenchymal stem cells on dopaminer gic neurons through anti-inflammatory action［J］.Glia，2009，57(1) ：13-23.

［15］ Bouchez G，Sensebe L，Vourch P，et al.Partial recovery of dopaminer gic pathway after graft of adult mesenchymal stem cells in a ratmodel of Parkinsons disease［J］.Neurochem Int，2008，52(7)：1332-1342.

［16］ Lee PH，Park HJ.Bone marrow-derived mesenchymal stem cell therapy as a candidate disease-modifying strategy in Parkinson＇s disease and multiple system atrophy［J］.J Clin Neurol，2009，5(1)：1-10.

［17］ Lee PH，Kim JW，Bang OY，et al.Autologous mesenchymal stem cell therapy delays the progression of neurological deficits in patients with multiple system atrophy［J］.Clin Pharmacol Ther，2008，83(5)：723-730.

［18］ 崔丙周.人臍血間充質干細胞移植治療脊髓損傷的實驗研究［J］.廣東醫學，2011，32(3)：303-305.

［19］ 王曉娟.臍血間充質干細胞移植治療多系統萎縮1例的臨床分析［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2009，13(40)：7955-7957.

［20］ 吳立克.臍血間充質干細胞移植治療帕金森病30例［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2009，13(40)：7951-7954.

［21］ 吳芳.臍血間充質干細胞移植對腦性癱瘓兒童神經系統功能的影響：20例分析［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2008，12(16)：3198-3200.