Wnt蛋白分泌機制的研究進展

李鳳立 靳衛國

( 1.泰山醫學院，山東 泰安 271016； 2.泰山醫學院附屬聊城醫院，山東 聊城 252000)

人類疾病的發生發展是多因素、多環節共同參與的復雜過程，其中涉及多條復雜的信號轉導通路。近年來，關于Wnt信號轉導通路的研究越來越受到人們的重視。Wnt/β-catenin信號通路是人體內一條極為重要的信號轉導途徑，與胚胎發育密切相關，對細胞的生長、增殖、分化及凋亡等生物學行為具有重要的調控作用。Wnt信號通路調節細胞生長、發育和分化的多個重要環節，在正常情況下對胚胎發育和成人的部分組織形成和功能發揮起著重要作用，而當該途徑紊亂異常時，會導致多種疾病的發生。隨著對該信號轉導通路的研究逐漸深入，現比較明確的Wnt信號轉導通路中的靶基因包括細胞增殖調控基因、發育控制基因和與腫瘤發生相關基因，如在細胞周期中能加速G1/S期進程的c-myc、cyclin D1及抗細胞凋亡的基因survivin 等。Wnt信號通路紊亂與眾多人類腫瘤的發生密切相關，目前有十幾種目前已知的高發性癌變都源于Wnt信號轉導途徑的失調[1-4]。

1 Wnt信號通路的組成

Wnt信號轉導通路至少存在下列路徑:經典的Wnt/beta-catenin通路;非經典的Wnt通路、Wnt/Ca2+和Wnt/PCP等途徑[5-6]。Wnt/β-catenin信號途徑是已發現三條Wnt信號途徑中研究最深入的部分，它的主要組分包括Wnt蛋白，卷曲蛋白(Frz)，散亂蛋白(Dvl或Dsh)，低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6(LRP5/6)，糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)，結腸腺瘤性息肉病蛋白(APC)，軸蛋白(Axin)，酪蛋白激酶 (CKI)，β-連環蛋白(β-catenin)，T細胞因子/淋巴細胞增強因子(TCF/LEF)等。在正常成熟細胞中無Wnt信號通路的轉導，GSK-3β與胞內的APC、Axin、CKI、β-catenin形成多聚蛋白降解復合體降解β-catenin，阻斷了其對下游靶基因的激活。當Wnt信號轉導通路的信號配體Wnt蛋白結合膜受體Frz，并激活胞漿內的Dsh，而磷酸化GSK-3β，使其從降解復合體脫落，因而β-catenin不能正常降解而在胞漿內異常聚集，大量游離的β-catenin進入核內，與轉錄因子TCF/LEF結合而導致wnt信號轉導通路的下游靶基因的轉錄激活。在這些成員中，Wnt 蛋白與Fz 的結合對整個通路起開關作用；β-catenin 則是該通路的一個關鍵成分子[7]。

過去的幾十年，關于Wnt信號轉導通路的研究主要集中在兩個方面:(1)各種Wnt通路在靶細胞中的傳遞過程；(2)Wnt通路對靶細胞發育、分化即目標基因的激活表達過程的影響。然而，關于在該信號轉導通路中類似開關作用的即有活性的Wnt蛋白在分泌細胞中是如何合成并被運輸到胞外發揮作用的，在這個過程中Wnt蛋白是如何被賦予功能和發揮作用的等等，針對這方面的研究國內外均較少[8]。

2 Wnt蛋白的結構與功能

Wnt是由最早發現的2個基因組合而來的,即果蠅wngless(wg)基因及小鼠Int-1基因。從線蟲到人類都有Wnt基因，現已克隆出19種Wnt基因家族的成員。Wnt蛋白是由350～400個氨基酸組成的分泌型糖蛋白，其蛋白序列高度保守且具有共同的特征。首先，都含有23個左右的高度保守的半胱氨酸(Cys)殘基位點，這些Cys殘基之間可以形成二硫鍵，指揮著Wnt 蛋白的正確折疊和運輸。其次，Wnt蛋白都在特定位點被脂質化修飾和N-糖基化修飾，這些修飾直接影響著Wnt蛋白的加工和轉運[9]。Willert等在轉染Wnt3a基因的小鼠L細胞培養基中純化小鼠Wnt3a時發現了另一種翻譯后修飾方法，即N-末端的77位半胱氨酸被棕櫚酰化(C77A)；Zhai 等也發現Wg被脂化修飾了；其中高度保守的半胱氨酸提示棕櫚酰化可能是Wnt的基本特點。盡管它們的控制機制并沒有完全闡明，但研究已證明，這些修飾位點的氨基酸發生突變后，Wnt蛋白不能分泌出胞，只能積累在胞內[9-10]。Wnt蛋白與相應受體的結合活化使Wnt信號轉導通路得以開啟。Wnt蛋白是一種調節細胞生長、發育和分化的分泌型糖蛋白，通過自分泌或旁分泌激活不同的Wnt 信號轉導通路在靶細胞中發揮作用。但它的合成、成熟、運輸及分泌是一個復雜的、高度監管的過程[11]。

3 Wnt蛋白的合成、成熟、運輸及分泌

Belenkaya[12]研究表明wntless和retromer復合體在Wnt蛋白分泌中起關鍵作用。Wnt蛋白在內質網中合成并修飾后，被運輸到高爾基體中，與高爾基體膜上的wntless組成復合物，一起被轉運到細胞膜上并釋放到胞外，而wntless通過某種途徑內陷回收進入胞內。此時retromer復合體能夠識別內吞的wntless，并把它回收到高爾基體中繼續發揮作用，防止其通過溶酶體途徑被降解[13]。

另外，Hausmann等[10]和Michaux等[11]研究也都提示wntless是Wnt蛋白分泌所必需的，且通過體內外基因干擾wntless實驗發現wntless對其他蛋白質的分泌沒有明顯影響，如Hh。wntless在線蟲和哺乳動物體內的高度保守性，以及在表達wnt蛋白的器官中wntless的保守性表達和wntless與Wnt蛋白綁定模式，均表明wntless是Wnt蛋白的忠實伴侶。免疫共沉淀實驗也顯示wntless和Wnt蛋白相互聯系在一起[14]，也支持以上觀點。在wntless突變型的果蠅中，wnt蛋白積累在胞內不能分泌出胞，Wnt 信號轉導通路的下游信號通路的靶基因激活也被阻斷，而其它的信號蛋白分子卻不受影響，因此不難推測wntless能特異性協助Wnt蛋白分泌出胞。雖然wntless的作用機制目前還未闡明，但多數研究結果均提示它可能作為一種分選受體，特異性的協助Wnt蛋白從高爾基體運輸到胞膜，或者還可能發揮修飾酶或分子伴侶的作用，協助wnt蛋白進行正確的折疊加工。而Wnt蛋白的某些修飾可能影響wntless對其的分選識別，影響Wnt蛋白的自分泌和旁分泌，調控Wnt信號轉導通路在腫瘤發生、發展中的作用。wntless的回收或降解對Wnt蛋白的轉運及分泌也是很重要的，但這種分選受體的平衡又依賴于胞內的retromer復合體的調控[5]。

Retromer復合物是一個多亞基組成的復合物，在哺乳動物中由分選亞基(VPs35、VPs29、VPs26)和錨接亞基(SNX1和SNX2)組成，它負責細胞中許多蛋白的運輸與回收[16]。在wntless作用被發現的同時，另外有兩個著名的實驗室也證實retromer復合體也是Wnt蛋白分泌所必需。retromer復合體的關鍵亞基vps35突變后，Wnt 蛋白分泌出現障礙，并且這種效應具有特異性。由于功能類似，可以推測在Wnt 蛋白的分泌過程中wntless和retromer復合體可能一起發揮作用。Franch-Marro等研究證實，Retromer復合體能夠分選回收wntless。wntless協助Wnt蛋白分泌出胞后，通過細胞內吞作用使其回收入細胞內核內體，這時Retromer復合體通過其分選亞基識別wntless，將wntless從核內體中逆向運輸到高爾基體中，防止它經溶酶體途徑被降解[17]。因此，可以推測Wnt 蛋白、wntless和retromer復合體形成的一個動態循環的模式：wntless協助Wnt 蛋白的分泌，retromer復合體分選回收wntless使其處于動態平衡中，共同保證著Wnt蛋白的正常分泌。在某種意義上考慮，控制或打破這個動態循環的平衡可以干擾wnt蛋白的功能性分泌，調控Wnt信號轉導通路在靶細胞的作用。

鑒于基因干擾技術的成熟及廣泛應用，我們可以通過該技術進一步研究調控Wnt 蛋白分泌的眾多因素和復雜機制。Bugarcic等[18]研究提示retromer復合體在分泌Wnt蛋白的細胞中對wnt信號轉導通路在細胞事件中也起著關鍵作用，尤其是對Wnt 蛋白的旁分泌。retromer復合體的亞基與TBC1D5和GOLPH3蛋白連接，在蛋白質從高爾基體的轉運活動中發揮作用。有學者進一步研究表明在DC細胞中由于Vps35能回收核內體的wntless，使其返回高爾基體重新發揮協助Wnt蛋白出胞的作用，所以它參與Wnt蛋白分泌的過程是通過wntless間接發揮作用的；而且雖然VPs35被干擾，它只能影響wntless的回收，而新的wntless分子會不斷的合成，因此wntless對Wnt分泌的影響作用更直接更明顯[8，15]。Coudreuse等[19]研究支也持此觀點，他們通過對HEK細胞中VPS35基因敲除的研究，發現wnt3A的分泌無明顯變化。

4 Wnt信號轉導通路的抑制劑研究

隨著對Wnt 信號轉導通路的深度研究，針對信號通路的各個層面分子的抑制劑也日益出現。經典Wnt 信號轉導通路受體抑制劑由分泌蛋白sFRP家族(the secreted Frizzled-related family)和Dkk家族(the Dickkopf family) 構成, 通過結合Wnt 分子和競爭性結合輔助受體LRP5/6，從而有效抑制Wnt信號轉導入細胞內, 發揮抑制經典Wnt信號通路的作用。其中sFRP家族包括sFRP、WIF-1、Cerberus和WISE，同時抑制經典Wnt信號轉導通路和非經典Wnt 信號通路。而DKK家族只抑制經典Wnt 信號通路[20]。針對Wnt 蛋白合成分泌方面的抑制作用研究較少，可能是Wnt蛋白的很多生化特性有很多謎團未解決。與其它信號分子不同，如成纖維細胞生長因子(FGF)，轉化生長因子(TGF)，Wnt 蛋白還不能進行大量的生產，廣泛研究、分析等。還有Wnt 蛋白復雜的翻譯后修飾和一系列高度特異性和研究較少的加工酶的修飾處理使得Wnt 蛋白結構功能的研究更加困難。隨著第一個Wnt蛋白結構研究清楚后，更多的研究將焦點集中到Wnt 蛋白上，從Wnt 蛋白的合成到成熟、功能性分泌及介導的信號轉導通路產生的復雜效應等過程正逐漸清晰[21]。如目前已證實Wnt 信號的激活必須Porcupine(Pro)參與，Pro對Wnt蛋白進行?；⑺鼈冨^釘到內質網膜上以刺激它們的轉錄后N-糖基化修飾，此過程對Wnt 蛋白的分泌是必需的[22]。

5 結 語

從已有的研究來看，經典Wnt 信號通路的啟動蛋白即Wnt蛋白的合成分泌涉及多種相關因子之間相互作用，有多種復雜的機制參與促進其成熟及其有功能的分泌。對目前已發現的重要相關因子如wntless和retromer復合體等的具體作用機制并未完全闡明，而且可能還有未發現的相關因子在其中產生作用。從Wnt 信號轉導通路的開關環節進行分析，對Wnt信號轉導通路進行更加深入的研究。對wnt蛋白質的合成、成熟和功能性分泌進行研究，以尋求在這一系列過程中通過外界因素如酶學修飾、藥物抑制、基因沉默等干擾因素影響Wnt 蛋白的脂化、棕櫚酰化及糖基化修飾或干擾其定位、轉運途徑等，進而調控信號通路在疾病發生、發展中的作用，為今后人類腫瘤針對該信號轉導通路開發新的腫瘤治療藥物提供更多的參考依據。

[1] Zimmerman Z F, Moon R T, Chien A J. Targeting Wnt Pathways in Disease[J]. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2012，35(10)：158-163.

[2] 王芳, 潘曉琳, 李鋒. Wnt/β-catenin通路異常在卵巢癌中的研究進展[J]. 農墾醫學, 2010,20(5):455-457.

[3] 劉向東,萬瑩鏵. Wnt信號傳導與腫瘤[J]. 癌癥進展, 2009,18(3):296-300.

[4] 莊瑜, 劉俊, 肖明第. Wnt蛋白:從合成到分泌[J]. 現代生物醫學進展, 2009,10(14):2769-2772.

[5] Lorenowicz MJ, Korswagen H C. Sailing with the Wnt: charting the Wnt processing and secretion route[J]. Exp Cell Res, 2009, 315(16):2683-2689.

[6] Widelitz R. Wnt signaling through canonical and non-canonical pathways: recent progress[J]. Growth Factors, 2005, 23(2):111-116.

[7] Kikuchi A, Yamamoto H, Sato A. Selective activation mechanisms of Wnt signaling pathways[J]. Trends Cell Biol, 2009, 19(3):119-129.

[8] 郭陳智. 人樹突狀細胞中WNT蛋白分泌機制的初步研究[D]. 華東師范大學, 2010.

[9] Tang X, Wu Y, Belenkaya T Y, et al. Roles of N-glycosylation and lipidation in Wg secretion and signaling[J]. Dev Biol, 2012, 364(1):32-41.

[10] Hausmann G, Banziger C, Basler K. Helping Wingless take flight: how WNT proteins are secreted[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2007, 8(4):331-336.

[11] Michaux G, Le Borgne R. Sorting, recycling and WNT signaling: Wntless and retromer functions[J]. Med Sci (Paris), 2009, 25(6-7):617-621.

[12] Belenkaya T Y, Wu Y, Tang X, et al. The retromer complex influences Wnt secretion by recycling wntless from endosomes to the trans-Golgi network[J]. Dev Cell, 2008, 14(1):120-131.

[13] Port F, Kuster M, Herr P, et al. Wingless secretion promotes and requires retromer-dependent cycling of Wntless[J]. Nat Cell Biol, 2008, 10(2):178-185.

[14] Gasnereau I, Herr P, Chia P Z, et al. Identification of an endocytosis motif in an intracellular loop of Wntless protein, essential for its recycling and the control of Wnt protein signaling[J]. J Biol Chem, 2011, 286(50):43324-43333.

[15] Zhang P, Wu Y, Belenkaya T Y, et al. SNX3 controls Wingless/Wnt secretion through regulating retromer-dependent recycling of Wntless[J]. Cell Res, 2011, 21(12):1677-1690.

[16] Seaman M N, Harbour M E, Tattersall D, et al. Membrane recruitment of the cargo-selective retromer subcomplex is catalysed by the small GTPase Rab7 and inhibited by the Rab-GAP TBC1D5[J]. J Cell Sci, 2009, 122(Pt 14):2371-2382.

[17] Franch-Marro X, Wendler F, Guidato S, et al. Wingless secretion requires endosome-to-Golgi retrieval of Wntless/Evi/Sprinter by the retromer complex[J]. Nat Cell Biol, 2008, 10(2):170-177.

[18] Bugarcic A, Zhe Y, Kerr M C, et al. Vps26A and Vps26B subunits define distinct retromer complexes[J]. Traffic, 2011, 12(12):1759-1773.

[19] Coudreuse D Y, Roel G, Betist M C, et al. Wnt gradient formation requires retromer function in Wnt-producing cells[J]. Science, 2006, 312(5775):921-924.

[20] Yeh J R. A Wnt inhibitor with a twist[J]. Chem Biol, 2011,18(12):1518-1520.

[21] Willert K，Nusse R. Wnt proteins[J]. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2012，4(9)：235-240.

[22] Komekado H, Yamamoto H, Chiba T, et al. Glycosylation and palmitoylation of Wnt-3a are coupled to produce an active form of Wnt-3a[J]. Genes Cells, 2007，12(4):521-534.