皮下埋置實驗對增塑淀粉生物安全性的評價

徐小川，姚 源，田 偉

(1北京積水潭醫院，北京100035;2北京市創傷骨科研究所)

淀粉作為天然高分子化合物在可再生資源中占據非常重要地位，具有豐富、價廉、可再生、不枯竭、污染小、可生物降解、生物相容性好、穩定性高、安全、無毒等特點，尤其經過適合的結構重組或修飾，可賦予抑制結腸癌、降低膽固醇、減少心血管疾病等生理活性，因而對其研究和利用日益引起國際上的高度重視［1］。增塑淀粉是北京市新型高分子材料制備與加工重點實驗室研發的新型生物可降解材料，強度和彈性大大優于普通淀粉;對小分子具有很好的吸附性，強于海藻酸鹽類多糖，加入止血材料或成骨因子有望在生物醫藥領域有廣泛的應用前景。因此，評價這一類醫療器械及材料植入體內的風險性也就顯得相當復雜且需要更加謹慎。此前，已經對該材料的細胞毒性進行測試［2］，部分反映了材料的安全性。為進一步評估材料的安全性，我們于2006年5月～2007年4月進行皮下埋置實驗。本實驗以Wistar大鼠為研究對象，依照YY/T 0127．8-2001(ISO 10993-6:1994)［2］進行皮下埋置實驗，觀察埋置后4、8、12周局部反應。選擇S-99可溶性止血紗布作為對照材料，S-99主要成分為纖維素，與淀粉均為高分子天然有機物，臨床中用于外用局部止血、保護創面，與實驗材料預期臨床使用相似。

1 材料與方法［3］

1．1 材料 依照中華人民共和國醫藥行業標準，實驗動物采用Wistar大鼠，雌雄不限。增塑淀粉類材料需填裝入直徑1．5 mm、長5 mm的管內。選用臨床使用的輸液器膠管，制成規定形狀，膠管植入前經高溫高壓消毒。增塑淀粉經60Co照射消毒備用，對照為S-99可溶性止血紗布(金臺牌，北京紡織科學研究所，密封包裝)。

1．2 方法

1．2．1 埋置方法 術前1 d對動物手術部位脫毛。手術當日受試動物腹腔注射水合氯醛0．7 mL麻醉，固定后用碘伏對脫毛部位消毒，然后鋪巾。在大鼠背部兩側距脊柱各1 cm處切開皮膚，切口長約1．5 cm;分離皮下組織，將膠管于無菌情況下植入大鼠背部皮下，每側各有兩個植入點;實驗側和對照側膠管植入皮下前分別填入增塑淀粉和止血紗布，止血，縫合線縫合。

1．2．2 觀察方法 實驗動物在埋植實驗材料后，分別于4、8、12周后分期處死。取出包括皮膚、皮下組織的植入塊，仔細修整組織塊并取出植入物，對界面和材料周圍組織進行大體觀察。然后，將標本置于10%甲醛中固定2 d，石蠟包埋切片，沿植入物長軸切片，蘇木精—伊紅(HE)染色，組織學觀察。主要觀察纖維包膜的形態和結構、炎細胞浸潤程度，以及有無膿腫、變性壞死、增生等情況。

1．2．3 評價方法 根據管端組織有無變性、壞死及其程度、炎癥細胞的數量、類型和浸潤范圍進行組織學評價，將組織反應程度分為以下4級。重度反應:管端組織失去原有形態結構，形成大面積壞死區，較多嗜中性多形核白細胞、淋巴細胞等炎性細胞浸潤;中度反應:管端組織小范圍變性壞死，呈中度的炎癥細胞浸潤;輕度反應:管端組織無變性壞死，散在少量慢性炎癥細胞，可見到淋巴細胞、漿細胞、巨噬細胞及異物巨細胞存在;無反應:管端組織沒有炎癥細胞浸潤，可由薄層纖維組織包繞小管。

2 結果

實驗動物術后活動正常，進食好，傷口一期愈合，無傷口感染。第4周取材中發現，實驗側及對照側膠管均被纖維包膜完整覆蓋，附近組織無紅腫、無血凝塊。HE切片顯示，實驗側與對照側均表現為異物反應，實驗側視野有肉芽腫，均屬輕度反應。見插頁Ⅰ圖3。第8周取材中發現實驗側及對照側膠管周纖維包膜厚度較前期無明顯變薄，外觀形狀無明顯變化。HE切片顯示，實驗側與對照側均表現為吞噬反應，均屬輕度反應。見插頁Ⅱ圖4。第12周實驗側及對照側膠管周纖維包膜厚度較第8周無明顯變薄，HE切片顯示實驗側與對照側均表現為吞噬反應，均屬輕度反應。見插頁Ⅱ圖5。

3 討論

淀粉作為天然高分子化合物，在可再生資源中占據非常重要地位。2001年，美國、比利時和以色列等國的研究人員發現，丙烯酸接枝玉米淀粉及淀粉與聚丙烯酸共混物均表現出較高的抑制胰蛋白酶活性的能力，以及對鈣、鋅離子有較強的吸附能力，適合作為多肽、蛋白質藥物的靶向給藥載體［4］。

采用海藻酸鹽作為組織工程骨支架載體，具有促進骨缺損部位骨愈合、防止出現骨不連等優點［5，6］，但其凝膠在生理環境中易溶解并失去凝膠特性，此過程不能控制和預測;同時，因其具有較強的親水性，故對蛋白質吸附較差，缺乏細胞特異性作用位置。許多研究集中于海藻酸鹽改性或者替代物。目前，研究最多的可吸收支架材料是聚乳酸或聚乳酸—羥基乙酸共聚物［7］，但是二者在降解過程中容易產生酸，易引起周圍組織的炎癥反應。增塑淀粉強度和彈性大大優于海藻酸鹽及普通淀粉，對小分子具有很好的吸附性。朱愛臣等［8］以本實驗材料為基礎制備了淀粉/聚乙烯醇引導組織再生膜，以期應用于頜面和身體其他骨組織缺損的修復。

本實驗中4、8、12周3個階段，實驗側及對照側的炎性反應一直存在且程度相似，顯示增塑淀粉的安全性不低于對照材料。這可能是因為皮下組織富含血管及疏松結締組織，異物反應表現強烈。同時，通過組織學切片可見放置材料的輸液器膠管周圍出現纖維包膜增厚，而管內并未有明顯的炎癥反應，提示組織學所見的細胞吞噬反應部分源于組織對膠管的反應。

本實驗采用自身左右對照［9］，在所有的觀察期發現實驗側、對照側均表現為異物反應，未見壞死組織，參照行業標準屬輕度反應，說明增塑淀粉在組織局部的毒性反應在可接受范圍。完全沒有不良作用的材料是很難找到的。生物醫用材料及裝置植入人體后，必定引起組織反應、血液反應、免疫反應及全身反應等生物學反應［10］，而其中又以組織反應和血液反應為初始反應。例如，植入物周圍組織將出現白細胞、淋巴細胞和吞噬細胞的聚集，并發生不同程度的急性炎癥。其感染的原因包括:植入手術過程中，皮膚或組織損傷，給微生物的侵入提供機會;生物醫用材料滅菌不徹底帶來的污染，生物醫用材料本身引起的無菌性炎癥等。因而，在生物學評價中要遵循設立對照的原則，只有這樣才能獲得結果的可比性。

有研究對若干生物材料采取白細胞趨化試驗、流式細胞儀法等體外試驗方法，以及大鼠皮下埋植、兔肌肉內埋植等體內試驗，來評價材料的組織毒性，并進行比較研究，對體內外試驗方法和結果進行相關性分析，結果表明體外、體內方法有良好的相關性［11］。因而，對于任何生物材料還應該參照現有標準進行相應的體內外聯合試驗。

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［2］徐小川，陳大福，石銳，等．增塑淀粉的細胞毒性實驗［J］．口腔頜面修復學雜志，2007，8(1):38．

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［8］朱愛臣，石銳，袁潤英，等．可降解多孔淀粉/聚乙烯醇復合膜的結構與性能［J］．中國組織工程研究與臨床康復，2010，14(34):6328-6332．

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［10］李玉寶．生物醫學材料［M］．北京:化學工業出版社，2003:22-25．

［11］張彩霞，聞學雷．生物材料體內外試驗相關性研究——細胞與軟組織毒性［J］．中國生物醫學工程學報，2001，21(2):122-127．