C型尿鈉肽在動物繁殖過程中的作用研究進展

賈振偉 張家新 安磊 吳中紅 田見暉

（1.內蒙古民族大學動物科技學院，通遼 028000；2.中國農業大學動物科技學院，北京 100193；3.內蒙古農業大學動物科技學院，呼和浩特 010018）

C型尿鈉肽（C-type natriuretic peptide，CNP）與心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）和腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）同屬于尿鈉肽家族成員，最初于1990年在豬的大腦中被分離提純［1］，廣泛分布于動物大腦、腎臟、心臟及血管等組織，具有維持心血管系統功能穩態、調控細胞增殖及促進骨骼生長等作用。值得注意的是，近年在小鼠中研究發現卵泡壁層顆粒細胞能夠分泌CNP，通過結合卵丘顆粒細胞上的受體產生cGMP進入卵母細胞，從而維持高水平cAMP抑制卵母細胞減數分裂［2］。目前，家畜卵母細胞體外成熟后發育能力較差，為了促進胞質成熟、提高體外發育能力，國內外普遍采用減數分裂抑制劑處理卵母細胞，然后進行體外成熟、受精及胚胎培養，但是一般認為這些減數分裂抑制劑沒有促進卵母細胞體外發育，甚至產生了不利的影響。CNP由22個氨基酸殘基組成，是生理性多肽物質，相對于化學合成的減數分裂抑制劑危害性應較小，將可能替代傳統的減數分裂抑制劑用于建立家畜卵母細胞體外成熟培養體系。此外，最近研究發現，CNP能夠促進小鼠卵泡發育，而且增加了促性腺激素處理后的排卵數量［3］?；谝陨习l現，我們認為CNP在作為生理活性的減數分裂抑制劑促進家畜卵母細胞體外發育及超數排卵增強劑提高超排效率方面將具有潛在的利用價值。

1 C型尿鈉肽結構

CNP是由22個氨基酸殘基組成的多肽（CNP-22），其核心部分含有一個由17個氨基酸通過二硫鍵組成的環狀結構，此結構環能夠與受體結合，對維持CNP生物活性十分重要［4］。CNP是鈉肽家族中最保守的成員，不僅物種間氨基酸序列高度一致，而且前體氨基酸序列也高度保守。例如，在牛、人、豬和小鼠中，成熟CNP氨基酸序列基本一致。人類的CNP前體（proCNP）含有103個氨基酸殘基，細胞內蛋白酶furin可用于proCNP產生具有生物功能的由53個氨基酸組成的多肽（CNP-53）［5］。在某些組織中，CNP-53被一種未知的細胞外酶分解為CNP-22。體內成熟的CNP以CNP-53和CNP-22兩種形成存在，其中CNP-22為循環的活性形式，而CNP-53為其儲存形式，CNP主要以CNP-22形式發揮生物學作用［6］。

2 C型尿鈉肽受體

目前，普遍認為哺乳動物鈉尿肽家族有3種受體：NPR1、NPR2和NPR3（或NPRA、NPRB和NPRC）。NPR1、NPR2為鳥苷酸環化酶偶聯受體（也稱GC-A、GC-B受體），NPR-3為鈉肽清除受體。鈉尿肽主要通過NPR-1和NPR-2受體介導發揮生物學作用，激活偶聯的鳥苷酸環化酶，使GTP轉化為cGMP調控下游靶物質。研究認為CNP是目前已知唯一的NPR-2天然配體，其結合NPR2的能力比ANP大50倍，比BNP大500倍［7］。NPR3與3種鈉肽結合能力基本一致。

NPR2蛋白細胞膜外結構與生長因子受體相似，大約由450氨基酸殘基組成，主要起連接CNP的作用，跨膜區域為20-25氨基酸殘基序列，細胞內結構由大約570個氨基酸殘基組成。而且，細胞內結構由激酶同型區域（KHD）、卷曲螺旋狀的二聚體及鳥苷酸環化酶催化區域組成。

3 C型尿鈉肽作用機制

CNP與受體NPR2膜外蛋白區域結合后，使細胞內結構的KHD去磷酸化、構象發生變化，同時結合ATP激活鳥苷酸環化酶，將GTP轉化為cGMP，然后激活下游信號通路。一般認為CNP引起細胞內反應依賴第二信使cGMP，目前研究證實cGMP能夠結合3種蛋白激活下游生理反應，分別為cGMP依賴蛋白激酶G（PKG）、cGMP結合磷酸二酯酶（PDEs）、環核苷門控離子通道蛋白。

當前對CNP通過cGMP轉導的信號通路研究比較清楚的是激活具有絲氨酸、蘇氨酸激酶活性的PKG引起生物學反應［8］。PKG基因有PKGI、PKGII兩種亞型。PKGI屬于細胞內溶質，主要在血小板、平滑肌、心臟及大腦表達，研究表明同源重組敲除PKGI基因導致小鼠血管平滑肌松弛及幼齡小鼠血壓升高［9］；PKGII主要位于細胞膜上，在腸、腎臟、軟骨組織、大腦及骨骼表達較高，敲除PKGII基因導致小鼠和大鼠生長矮小［10］。磷酸二酯酶（PDEs）家族主要由11個成員組成，能夠降解環核苷酸為5'核苷一磷酸，是環核苷酸的關鍵調控者。目前研究認為，cGMP能夠引起PDEs構象發生變化，調控其活性。例如，cGMP結合PDE5后促進了cGMP的分解，PDEs構象變化也能激起cAMP和cGMP信號對話。例如，cGMP結合PDE2導致細胞內cAMP含量下降；相反，cGMP抑制PDE3活性，增加細胞內cAMP含量。

此外，cGMP也能通過調控環核苷門控離子通道蛋白介導細胞內反應。這些離子通道蛋白C端含有環核苷位點結合區域，能夠結合cAMP或cGMP。但是，目前CNP與環核苷門控離子通道蛋白相關聯的功能數據尚未見報道。

4 C型尿鈉肽在動物繁殖過程中的作用

Sudoh 等［11］首先對豬大腦中的CNP進行了分離鑒別，隨后研究確認其為神經遞質及心血管肽，由此推測CNP可能參與動物繁殖機能調控。

4.1 C型尿鈉肽在雄性動物繁殖過程中的作用

4.1.1 C型尿鈉肽在雄性動物生殖器官上表達 Middendorff 等［12］研究發現，CNP和受體在人類睪丸中均有表達。El-Gehani 等［13］研究結果顯示，CNP在胎兒期大鼠睪丸間質細胞內表達；近年研究發現大鼠出生時CNP表達量較多，然后逐漸下降，在出生后35 d表達再次增加［14］。小鼠出生后CNP表達模式與大鼠相似，出生時表達量較高，然后逐漸下降，在出生后20 d表達再次增加。Nielsen等［15］采用放射免疫方法檢測了公豬多種組織的CNP蛋白表達量，發現CNP在附睪、生精囊泡和前列腺等生殖器官含量最高，并且mRNA在附睪、生精囊泡比其他組織高125倍。以上研究結果說明CNP在調控雄性動物繁殖過程方面可能具有重要作用。

4.1.2 C型尿鈉肽在雄性動物繁殖過程中的調控 Chrisman等［16］研究發現CNP增加了豬精液的cGMP水平。由此推測CNP可能通過促進cGMP產生調控睪丸的內分泌功能。隨后研究證明CNP能夠促進睪丸間質細胞睪酮的分泌，同時也參與睪丸間質細胞和支持細胞功能的調控［17，18］。另外，CNP還可能以旁分泌的方式通過影響曲細精管的舒張來調控精子的傳遞和睪丸血液的供應。此外，普遍認為cGMP不僅能夠調控睪丸的自分泌和旁分泌功能，同時也對陰莖勃起功能有影響。在兔子和大鼠中，CNP通過結合海綿體細胞膜上的NPR2受體，引起陰莖平滑肌肌肉細胞的松弛。Küthe等［19］發現，NPR2受體在人的陰莖海綿體組織中表達，說明CNP對陰莖勃起有作用。此外，體外培養期間，CNP促進了支持細胞表達雄激素結合蛋白、抑制素B和轉鐵蛋白，由于這些基因蛋白與血管屏障形成相關，揭示CNP可能參與了血管屏障的動態調控［14］。

4.2 C型尿鈉肽在雌性動物繁殖過程中的作用

4.2.1 C型尿鈉肽在雌性動物生殖器官上表達 Cameron等［20］利用mRNA原位雜交技術發現小鼠胎盤組織中CNP大量表達始于性交后10.5 d。Stepan等［21］檢測到灰鼠胚盤組織內CNP mRNA在性交后9.5-15.5 d表達最高。大鼠胎盤CNP表達與ANP相似，在性交后16 d表達最高。胎盤、子宮以及卵巢組織間CNP表達的比較研究表明，胎盤CNP mRNA表達高于子宮和卵巢。另外，人類妊娠期胎盤組織的NPR1及NPR2表達變化幅度較大的研究結果進一步支持胎盤組織中鈉肽系統功能性作用［22］。

Stepan等［23］發現，未妊娠小鼠子宮和卵巢組織CNP mRNA的表達最高，甚至超過了大腦和腎臟組織。更加細致的研究表明，子宮內CNP的表達受其他激素調控。例如，去勢小鼠腹膜內注射雌激素以劑量依賴的方式促進子宮內CNP表達［24］。大鼠子宮中CNP表達受發情期影響，而且在發情初期表達最高。CNP的表達依賴發情周期歸咎于子宮內容物及液體內容物質或者雌激素的變化［25］。同樣，發情周期內大鼠卵巢組織中CNP和NPR2表達也呈時間依賴性的變化。此外，CNP/NPR2體系在卵巢組織中表達亦受激素調控，研究表明具有FSH功能作用的eCG注射小鼠后促進了 CNP/NPR2 mRNA表達，而具有LH功能作用的hCG抑制了其表達［26，27］。

4.2.2 C型鈉肽在雌性動物繁殖過程中的調控 近年小鼠上的研究發現，CNP主要在卵泡壁層顆粒細胞表達，NPR2主要在卵丘顆粒細胞上表達，體外培養期間CNP抑制了卵母細胞減數分裂，敲除CNP基因后卵母細胞啟動了減數分裂，說明CNP是體內在LH峰值啟動前抑制卵母細胞減數分裂的功能性物質，其抑制減數分裂的機制是CNP作用于卵丘顆粒細胞后激活NPR2，產生大量的cGMP并進入卵母細胞，抑制PDE3A的活性，減少cAMP的分解，維持減數分裂的靜止［2］。另外，McGee等［28］發現在卵泡竇前向竇內轉變時期，8-bromo-cGMP（一種cGMP的類似物）可以降低卵泡閉鎖，同時促進了有腔卵泡的發育。由此推測，CNP可能通過結合NPR2產生cGMP促進卵泡發育。最近研究結果顯示，小鼠注射CNP后促進了卵巢上早期和后期有腔卵泡發育，使用eCG超排處理后增加了排出的卵母細胞數量，并且體外培養后沒有影響卵母細胞發育能力［3］。一般認為FSH通過作用卵泡細胞G蛋白偶聯的腺苷酸環化酶產生cAMP調控卵泡的生長發育，當前研究揭示CNP通過激活鳥苷酸環化酶產生cGMP也能促進卵泡發育，但是FSH和CNP通過第二信使cAMP/cGMP是否存在交叉作用通路調控卵泡發育尚不明確。

綿羊妊娠后期子宮內cGMP含量提高了38倍，說明激活了鈉肽系統，促進子宮內cGMP的產生［29］。McNeill等［30］研究發現綿羊血液中母源CNP蛋白含量低，且穩定存在，但妊娠后40-50 d迅速增加，在妊娠120 d時達到高峰，在產前7 d迅速下降至妊娠前水平。小鼠子宮CNP mRNA濃度在妊娠期提高了7倍多，而卵巢中的水平則降低到未妊娠對照組的10%。以上數據揭示妊娠期間CNP可能通過松弛平滑肌肌肉抑制子宮收縮維持妊娠過程。CNP誘導的松弛可能不依賴cGMP介導的信號通路，因為抑制NPR1和NPR2活性并沒有影響CNP對子宮肌層的作用［31］，具體的調控機制還有待進一步研究。

此外，羊妊娠期間子宮動靜脈連接高濃度的CNP，揭示子宮胎盤組織是母源CNP的主要來源。但是，目前關于子宮和胎盤各自對母源CNP的貢獻能力尚不明確。McNeill等［30］研究發現綿羊母源CNP含量與妊娠胎兒數量呈正相關，隨后McNeill等［32］研究結果顯示，在綿羊妊娠期間，胎盤組織是母源CNP含量的主要貢獻者，合成的CNP與胎盤成熟和胎兒發育密切相關。然而，在人類研究結果顯示，胎兒血漿CNP的含量高于母源水平，且母源與胎兒間梯度含量較低，表明母源和胎兒可能獨立產生CNP。因此，在妊娠期間調控胎盤成熟和胎兒發育的CNP合成在物種間可能存在差異。

5 應用前景

目前，在畜牧業生產方面，雄性動物存在一些繁殖障礙問題，如陰莖勃起困難。由于CNP能夠通過產生cGMP調控雄性動物陰莖勃起，將可能在治療此項疾病方面發揮一定的作用，提高雄性動物的繁殖力。此外，也可以開發治療男性因陽痿導致不育的藥物。

鑒于CNP能夠促進雌性動物卵泡發育，有提高排卵數量的作用，其可以在提高牛、羊等大家畜超排效率方面具有一定的利用價值。此外，目前由于家畜卵母細胞來源于卵巢上不同生長時期的卵泡，盡管體外成熟培養后能夠完成減數分裂，但由于脫離卵泡內生理環境，體外難以獲得支持受精后胚胎發育的胞質成熟，逐漸成為提高牛體外胚胎發育能力的瓶頸因素。另外，幼畜超排技術近年來有較大進展，但同樣存在胞質不成熟導致胚胎發育能力低的問題。鑒于卵母細胞體內成熟過程涉及的生理條件及影響因素，許多學者理論上認為體外維持卵母細胞靜止，模擬體內LH激素刺激啟動GVBD前卵母細胞經歷胞質成熟的歷程，是提高受精后胚胎發育能力的一種重要的手段。但是，目前體外使用的減速分裂抑制劑沒有顯著的作用效果，一些物質甚至具有不利影響。值得注意的是，近年來一些學者研究發現CNP體外能夠抑制卵母細胞減數分裂，且由于其為生理活性物質，用于體外成熟培養更接近于牛卵泡內的生理環境，對卵母細胞毒害應該小于化學合成的減數分裂抑制劑。因此，在體外用新型的減數分裂抑制劑提高卵母細胞發育能力方面將具有潛在利用價值。

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