采后殼聚糖處理對果實-病原菌互作中形態結構的影響

張 璐，曾凱芳,2,*

(1.西南大學食品科學學院，重慶 400716；2.西南大學 國家食品科學與工程實驗教學中心，重慶 400716)

目前，大量合成殺菌劑被用于控制果實采后病害，由于公眾和學者越來越重視合成化學物質在食物鏈的積累問題，我們急需找到一些方法替代化學殺菌劑。殼聚糖(chitosan)學名為β-(1,4)聚-2-氨基-D-葡萄糖，來源于真菌細胞壁及介蟲(蟹、蝦)外殼，是甲殼素的脫乙酰產物，具有安全、無毒、抑菌、可食及生物降解等多種特性。殼聚糖具有延緩果實成熟衰老、直接抑菌、作為激發子誘導果實抗性的功能，目前殼聚糖在控制采后病害中具有很大潛力，它對許多園藝產品采后病害控制都有效果，如蘋果、覆盆子、梨、番茄、獼猴桃、草莓、甘椒、黃瓜、桃、荔枝等[1-5]，目前已用于延長果蔬貨架期。殼聚糖的抑菌功能與其質量濃度、分子質量、脫乙酰度及果實的種類密切相關，如1%或2%殼聚糖對控制采后青霉菌(Penicillium expansum)侵染蘋果有效果[5]，質量濃度1g/100mL、分子質量小于5×104u的殼聚糖對控制采后甜櫻桃腐敗效果更好[6]。通過基團的化學修飾而制備的殼聚糖衍生物具有比殼聚糖更好的溶解性或抑菌性[7-9]。

用殼聚糖處理采后果蔬，殼聚糖、受病害感染的果實及病原菌在相互作用、相互識別的過程中，形成了一種錯綜復雜的關系。第一，病原菌侵染果實，從而獲取營養，對果實的結構和生理代謝產生影響；第二，病原菌的侵染激發了果實自身的抗病能力，可以在一定程度上抵抗外界各種脅迫對果實造成的不良影響；第三，殼聚糖不但能直接作用于病原菌，影響它的侵染能力，也能作為一種天然信號分子，引起果蔬組織內一系列抗性相關防衛反應的發生。目前對殼聚糖控制果實病害的研究多從其防治效果、對病原菌的抑菌機理、提高果實抗病性等方面單獨入手，而殼聚糖發揮作用是殼聚糖-果實-病原菌三者共同相互作用的結果，因此本文從互作的角度，通過最直觀的形態結構變化來說明殼聚糖在控制采后果實病害中的作用。

1 殼聚糖與采后果實-病原菌的互作關系

病害的發生往往是病原菌與寄主相互作用的結果。病原菌侵入果實多是通過皮孔或微傷口潛入到果實內部，在組織、細胞及亞細胞水平可觀察到一系列的病理變化，這些變化因病原菌的寄生性的差異而不同。病原菌的致病途徑主要有破壞宿主細胞結構、產生宿主細胞壁降解酶、產生毒素、影響植物激素、影響宿主基因組功能等[10]。在果實-病原菌互作中，受病原菌誘導，引起果實體內病組織或臨近組織中生理功能及生物能量的改變。果實有預存和誘導兩類防衛系統。前一系統的成分是細胞壁的角質、蠟質、木質素、栓質、特殊氣孔結構、小分子抗病物質、種子預存的抗真菌蛋白和能與真菌幾丁質結合的凝集素、破壞真菌細胞透性的蛋白質、核糖體失活蛋白等。后一系統是植物的基本防衛系統，它又分為局部的抗病反應和系統的抗病反應兩類。果實在抵御病原菌的過程中會發生細胞結構改變[11-12]，木質素的產生，保衛素的合成和積累，抗性酶(過氧化物酶(peroxidase，POD)、多酚氧化酶(polygalacturonase，PPO)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase，PAL))與活性氧相關酶系、編碼病程蛋白酶系、酚類物質、其他種類物質以及能量的變化等。通過這些形態、生理、生化水平的變化，果實才能夠抵御病原菌的侵染。

殼聚糖對果實病害的防治機制主要有：1)殼聚糖的抑菌性。目前的研究表明，酸性條件下，殼聚糖分子上的—NH2質子化而帶正電荷，可以與帶負電的細胞或帶負電的物質(如蛋白質等)相互作用，吸附在病原菌細胞表面，改變其細胞內外正常電化學勢，影響細胞膜正常的生理功能，干擾病原菌正常的新陳代謝活動[13]；2)殼聚糖的誘導果實抗病性。殼聚糖在一定程度上誘導果蔬組織木質素、植保素以及其他抗菌物質(如酚類、脂肪酸等)含量升高，影響果實細胞壁、皮孔等結構的變化，阻礙病原菌的侵襲[14]；3)殼聚糖的成膜性，殼聚糖在果實表面形成一層天然屏障，阻礙病菌的侵入，同時通過調節果實生理代謝延緩衰老，降低發病率。研究顯示，1.5%殼聚糖包膜處理草莓后果實無明顯真菌病害的發生，并顯著降低草莓的衰老[15]。這3種機制都離不開殼聚糖-果實-病原菌三者的相互作用。殼聚糖直接影響病原菌入侵的途徑，使其形態發生變化，影響其在果實組織中的發育過程，另一方面誘導果實產生抗性，抗性相關物質含量增加，細胞發生形態變化以抵御病原菌的入侵。

2 殼聚糖對果實-病原菌互作中病原菌形態結構的影響

2.1 對病原菌形態結構的直接影響

殼聚糖對病原菌有直接抑制作用，已有的生化和超微結構的研究都表明，殼聚糖的抑菌主要原因可能是使菌體細胞膜功能喪失(改變病原菌細胞膜的流動性和通透性)和菌體細胞壁破壞。不同分子質量的殼聚糖對各種植物病原菌的生長以及植物病原真菌孢子萌發形成菌絲體都有明顯的抑制作用。這種抑制作用的強弱，因殼聚糖的分子質量、濃度、脫乙酰度等及植物病原菌的不同而各有差異。Cheah等[16]用掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)觀察了殼聚糖處理對胡蘿卜上核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)菌絲的影響，發現菌絲形態變畸形(扭曲和分枝)、菌絲死亡(細胞質消失)。Benhamou[17]研究了殼聚糖對引起番茄腐敗的Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici的生長、形態學和超微結構的影響，用光學顯微鏡觀察到殼聚糖引起菌絲膨脹和變形。Bautista-Banos等[18]報道，殼聚糖處理使病原菌菌絲膨大卷曲，被疏松的細胞壁包裹。Sánchez-Domínguez等[19]通過透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)觀察到經殼聚糖處理后A. alternata孢子和菌絲體超微結構變化，這和殼聚糖的抑菌作用有關，病原菌發生細胞質分裂、原生質膜收縮、孢子崩解和質壁分離等變化。Barka等[20]和El Hassni等[21]報道殼聚糖能使灰霉菌(Botrytis cinerea)和Fusarium oxysporum f. sp. albedinis菌絲形成大囊泡或者細胞變空失去細胞質。對真菌孢子進行碘化丙錠(propidium iodide，PI)染色發現，25℃條件下5000μg/mL殼聚糖對B.cinerea和P.expansum孢子的質膜均有明顯的破壞作用，并且處理時間越長，質膜損傷程度越高[22]。

殼聚糖的抑菌作用是其在病原菌細胞外和細胞內共同作用的結果。在細胞外，由于殼聚糖為甲殼素的多聚陽離子衍生物，能與病原菌細胞表面的生物大分子帶負電的側鏈相互作用，形成聚合物成為物理屏障，阻礙細胞內外正常代謝和物質交換，影響病原菌細胞膜的流動性和通透性，影響細胞質膜完整性，造成胞內物質滲漏，進而抑制病原菌的生長。廖春燕[23]在殼聚糖對番茄枯萎病菌的拮抗作用研究中發現，0.5mg/mL殼聚糖處理1h，番茄枯萎病菌菌絲的滲透率為29.57%(對照僅5.24%)；在殼聚糖處理90min后，菌絲的電解質滲透最為明顯。Palma-Guerrero等[24]以粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)為模型研究了殼聚糖使其質膜滲透率增加、細胞死亡和溶胞的過程，發現殼聚糖使病原菌細胞滲透率增加和被吸收進入病原菌細胞是一個耗能的過程，且不同的細胞類型(分生孢子、芽管、營養菌絲)對殼聚糖的敏感性不同。El Ghauth[25]報道殼聚糖處理增加了匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)和B. cinerea細胞滲透率，說明細胞膜、細胞壁受到損壞。Liu Hui等[26]通過檢測培養基中的β-半乳糖苷酶的活性，檢測細胞滲出物在260nm波長處的吸收度以及檢測熒光探針NPN的熒光強度的變化等多種手段證明，殼聚糖對細胞內膜和外膜的完整性均造成破壞。在超微結構上，研究發現殼聚糖處理對病原菌細胞的形態影響。以上研究都表明，在殼聚糖的作用下，病原菌細胞發生物質滲漏，膜完整性受到破壞。殼聚糖目前普遍認為大分子質量的殼聚糖可能主要是通過在胞外發揮作用起抑菌作用的，但對細胞質膜的破壞作用尚缺乏系統直觀的研究[27]。

在細胞內，殼聚糖作為信號分子，誘導細胞內發生一系列的生化反應，或直接進入細胞作用于胞內物質。Benhamou[17]在超微結構上發現殼聚糖處理的細胞發生質膜變化、細胞質顯著凝聚。Li Yongcai等[28]報道，殼聚糖處理引起細胞質異常分布、細胞器無膜、細胞壁變厚等變化，高質量濃度的殼聚糖能使細胞嚴重損傷，包括細胞膜、細胞壁破裂、細胞質流出。目前已有人將殼聚糖低聚物進行標記，研究殼聚糖進入病原菌細胞后的作用，Xu Junguang等[29]提取的胞內核酸在體外進行凝膠阻留實驗的結果表明殼寡糖能夠與DNA和RNA緊密結合，殼聚糖(尤其是低聚物)很有可能是進入細胞后與細胞內的特定靶物質(如核酸)相互作用，引起胞內物質紊亂，進而起到殺菌作用。

隨著殼聚糖的抑菌機理備受關注，雖然目前普遍認為殼聚糖在胞外的作用是其抑菌的主要機制，但是其在胞內的作用也不容忽視，今后應該對其進入細胞的方式，細胞內存在殼寡糖的受體和作用位點，及其在細胞內的信號轉導等進行更深入的研究。

2.2 對病原菌形態結構的間接影響

殼聚糖除了有直接抑菌作用外，還能通過影響果實分泌對病原菌起拮抗作用的小分子次生代謝產物如植保素或抗毒素，以及能分解病原菌細胞壁的胞壁降解酶，從而對病原菌形態結構產生間接影響。這些物質由果實組織產生釋放出來，作用于病原菌細胞，對其形態結構產生破壞。

對病原菌作用的主要胞壁降解酶有：1)殼聚糖酶能水解病原真菌的細胞壁，抑制病原物生長，產生新的激發子誘導植物一系列防御反應。鐘秋平[30]研究了采前噴施殼聚糖對采后接種處理毛葉棗果實腐爛的影響，得知4mg/mL殼聚糖可誘導毛葉棗殼聚糖酶較對照升高23.4%。2)幾丁質酶(chitinase，CHI)的天然底物是幾丁質，而許多植物病原真菌細胞壁的主要成分是幾丁質，因而幾丁質酶對病原菌細胞壁具有降解作用，幾丁質酶是病程相關蛋白(PR)的重要組成部分，在植物抗病中除具有直接抑制病菌的作用外，還有從病菌壁上釋放激發子的作用。李美芹[31]測試了不同分子質量的殼聚糖對番茄葉霉病的作用，結果表明，3、82、213kD的殼聚糖能誘導番茄幾丁質酶較對照升高95.5%、263.3%、242.7%。3) β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase，GLU)也是病程相關蛋白(PR)的一種，它可通過對病原菌菌絲的直接裂解作用，促進病原菌細胞壁裂解和植物酚類物質的合成，從而抑制病原菌的進一步侵染[32]。李美芹[31]觀察不同質量濃度的殼聚糖對番茄葉霉病的作用結果發現，3mg/mL和6mg/mL殼聚糖可誘導番茄β-1,3-葡聚糖酶較對照升高117.6%和428.0%。殼聚糖處理增強了柑橘和草莓內CHI和GLU活性[33-34]。Meng Xianghong等[35]研究發現殼聚糖處理后，梨果實GLU活性明顯增加。

這些形態和物質的變化使得病原菌失去侵染能力或者侵染力減弱，從而保護了果實組織。但是，病原菌對殼聚糖也會產生一些防御反應，如形成子菌絲的細胞質變稠密，細胞壁變厚等。Benhamou[17]發現了病原菌細胞中幾丁質等非結晶的物質發生異常沉積，β-1,3-葡聚糖酶和脫乙酰幾丁質酶活性增強。幾丁質等物質合成增加的生理學意義可能是平衡細胞壁改變和質膜逐漸收縮所形成的壓力。

雖然不同研究者從各個角度探討了特定分子特征殼聚糖對不同種屬病原微生物細胞結構和生理代謝的影響，但缺乏系統性的研究。今后應在利用熒光或膠體金標記殼聚糖研究其作用部位以及對細胞膜的影響方面加強研究[27]。

3 殼聚糖對果實-病原菌互作中果皮細胞結構的影響

3.1 對果皮細胞結構的直接影響

果實的細胞壁可以維持細胞具有一定形狀，還可以保護原生質體，對外界病原菌微生物的入侵具有一定的抵抗作用。它是植物抵御外來侵染的第一道有效屏障，當病原物侵染時，細胞壁部分被破壞，誘使植物細胞對細胞壁進行修復，加速非蛋白性物質在細胞壁的沉積，細胞壁加厚并木質化。果實在受到病原微生物侵染時，在菌絲與寄主細胞接觸的寄主細胞與質膜之間，常有胞壁沉積物的形成，它是抵抗病原菌侵染的重要防衛系統之一，并且增強了寄主細胞壁對病菌入侵的抵御能力，沉積物中往往存在著大量的纖維素、半乳糖、β-1,3-葡聚糖等成分。殼聚糖處理能使果實果皮細胞壁變厚，促進木質化，更利于抵御病原菌的入侵。Nicole等[36]用殼聚糖處理番茄，當鐮刀菌入侵時，番茄細胞壁顯著加厚，胞間被填塞。

寄主植物在受到病原菌侵染時，寄主細胞在侵染點處要分泌類似于胞壁沉積物的物質，即乳突結構，一般位于植物細胞壁與質膜之間。乳突的形成與病原菌的侵染密切相關，乳突可能具有物理的和化學的抑制病菌入侵的作用，即乳突性。Nicole等[36]用研究發現用殼聚糖處理的番茄，果皮細胞在病菌侵入處形成大量乳頭狀突起，病原菌被包埋在致密的顆粒狀物質中，不能進一步擴散，而且顆粒狀物質中似乎還有殺菌物質產生，使植物對病原菌產生了有效的抗性。

木質素是一種重要的物理抗菌物質，它的形成和松柏醇產生的甲基化醌與HRGP之間的共價交換有關，植物抗病激活劑的誘導導致木質素在細胞壁沉積而構成致密、不易穿透的屏障，阻止了病菌的生長繁殖，從而保護細胞免受侵害[37]。木質素是由4種醇單體(對香豆醇、松柏醇、5-羥基松柏醇、芥子醇)形成的一種復雜的酚類化合物，它與纖維素、半纖維素一起構成植物骨架的主要成分，木質素沉積于細胞壁，并以共價鍵與細胞壁結合。鐘秋平[30]在研究采前噴施殼聚糖對提高毛葉棗抗病能力時發現，殼聚糖處理的果實在整個成熟過程中木質素含量都明顯高于對照，木質素含量隨著果實成熟度的增加而逐漸增加。研究表明[38]，殼聚糖處理的馬鈴薯塊莖中黃酮類物質和木質素含量增加。PAL是苯基丙酸類合成路徑的第一個酶，并和酚類化合物、植保素、木質素合成有關。有報道[39]，殼聚糖處理后的小麥葉中PAL的活性、木質素的含量都有所上升。Vasconsuelo等[40]也在歐茜草細胞培養實驗中證實殼聚糖可誘導植物細胞壁木質化。

富含羥脯氨酸糖蛋白(HRGP)是高等植物中特有的一種結構蛋白，其特點是羥脯氨酸含量高達30%～40%，HRGP可在被各種病原物侵染的植物中積累，也可被各種誘導因子所誘導。HRGP也是細胞壁中木質素沉積的位點，木質素也是植物體內的一種重要的物理抗菌物質，它與HRGP一起作為結構屏障物，起加固細胞壁的作用。周自云等[41]用0.1mL 30%殼聚糖誘導楊樹愈傷組織，發現殼聚糖處理的愈傷組織HRGP含量呈現持續增加的趨勢，在殼聚糖處理96h后含量達最高(74μg/mg)，較空白對照增加了1.1倍。

據報道[42]，殼聚糖能誘導侵染局部和整個植株系統性發生一系列反應，包括信號傳遞、病原相關蛋白及抗菌成分的聚集和激活。殼聚糖在植物體內誘導作用的機制可能分為2步，首先，植物組織細胞內具有識別和接受殼聚糖刺激信號的特殊受體，對殼聚糖進行分子識別，通過構型變化激活胞內有關酶的活性；其次修飾胞內基質后產生激活性和適應性的信號分子，并通過對特殊基因的調節激發組織細胞產生防衛反應。除了誘導果實生成抗性相關物質外，殼聚糖處理還引起果實體內形態學上的變化，通過促進果實木質素、植保素的合成來增加果實細胞壁抗真菌穿透的能力，從而提高果實的抗病反應能力。另外，殼聚糖處理果實后，經常會在侵入點附近黏著，此現象的主要功能除了形成物理屏障外，還能引起周圍組織發生過敏反應，并伴隨有H2O2的積累，誘導植物細胞壁增厚，這對植物其他健康組織是一個警示信號[43]。

3.2 對果皮細胞結構的間接影響

病原菌穿過細胞壁是通過分泌細胞壁水解酶直接突破果實表皮防御機制，造成細胞壁果膠、纖維素等的降解，引起果皮組織結構塌陷、崩解，借此力量侵入宿主細胞，并通過降解的植物細胞壁多聚體成分獲得養分。根據酶作用的底物，可將病原菌分泌的細胞壁水解酶分為以下幾種：角質酶(Cutinase)破壞植物體表面的角質層；果膠酶(Pectinase)破壞植物細胞的中膠層，其中果膠酶包括多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase，PG)、果膠甲酯酶(PMG)以及果膠裂解酶(Pectate lyase，PE)等；纖維素酶(Cellulase)降解細胞壁纖維絲；半纖維素酶(Hemicellulase)；蛋白酶(Protease)，蛋白質可作為細胞膜成分和植物細胞結構成分，因此寄主蛋白質被病原物質分泌的蛋白酶降解可嚴重影響到寄主細胞的結構和功能。殼聚糖處理會影響病原菌胞壁降解酶的分泌，從而間接保護果實果皮的細胞結構。

El Ghaouth等[44]研究了殼聚糖處理對B.cinerea侵入甜柿子椒的過程的影響，特別是對病原菌降解果實細胞壁成分的影響。他們從B.cinerea感染組織中分離出了細胞壁組織浸解酶，這些酶和宿主細胞降解及果膠減少有關，其中果膠裂解酶、多聚半乳糖醛酸酶對病害發生有重要意義[45]，B.cinerea的主要生長方式是寄生，因此生成PG等酶和有機酸從而降解宿主細胞是它寄生的重要機制[46]。果膠降解被認為是其他細胞壁多聚物降解的前提[45]，在感染組織中，PG活性升高，纖維素酶活性未顯著升高，但是果膠顯著減少、纖維素降解，表明病原菌產生的酶降解了果膠多糖類物質。研究中經殼聚糖處理后，一方面宿主細胞壁果膠結合位點和纖維素的緊密規律排列受到保護，另一方面殼聚糖能使B.cinerea減少產生PG，從而阻止菌絲通過損傷宿主細胞而侵入果實體內，阻止了B.cinerea對果實的傷害。

4 結 語

綜上所述，殼聚糖通過和病原菌-果實的相互作用來控制果實病害，在形態結構方面，主要表現在：1)殼聚糖具有直接抑菌作用，通過在病原菌胞內和胞外的共同作用，影響其細胞質膜完整性，細胞內物質發生改變，胞內物質滲漏，孢子、菌絲等形態發生變化，從而無法正常生長；2)殼聚糖通過誘導果實產生對病原菌的胞壁降解酶，使病原菌發生形變，無法繼續侵入果實組織，最終被殺死；3)殼聚糖能誘導果實產生抗病性，除了誘導產生一些抗性物質以外，還能使果實產生結構抗性，即組織形態結構發生改變以抵御病原菌的入侵；4)病原通過分泌一些胞壁降解酶侵入果實細胞，殼聚糖能夠抑制這些酶的產生，防止對果實細胞組織造成形態結構上的損害，從而保護果實組織不受病原菌的感染。在殼聚糖-果實-病原菌三者關系中，存在多層次的影響和作用，其中任何一個出現質和量的變化都可能引發整個作用機制的變化，而且由于其生理生化影響變化在先，結構變化在后，因此以形態結構水平研究為基礎，深入開展生理生化及代謝途徑變化等相關研究，說明引發結構變化的深層次原因，是今后研究的重點和關鍵。

殼聚糖對植物病原菌抑菌機理是十分復雜的，要經過一系列復雜的過程且抑菌程度有限。在實際生產應用中僅僅依靠殼聚糖類誘抗劑的作用并不能有效控制病害的發生。現階段殼聚糖類物質與傳統保鮮方法的復合使用是更為有效的方法。其中，殼聚糖和拮抗菌復合使用是當下生物防治領域研究的熱點：El Ghaouth等[47]研究表明采后拮抗酵母Candida saitoana與殼聚糖衍生物聯合處理能對蘋果青霉病和灰霉病及柑橘綠霉病產生協同增效的控制效果。Sharma等[48]研究顯示，酵母Candida utilis與殼聚糖配合使用對番茄果實病原菌Alternaria alternata和Geotrichum candidum的拮抗效力顯著提高。

殼聚糖具有抗病譜廣、持續時間較長、對環境無污染以及有效作用濃度低等特點，因而在果蔬病害控制方面具有良好的應用前景。由于基因工程技術、純化和有機合成技術的發展，殼聚糖對果實-病原菌互作的影響及它在果實采后病害防治中的機理也將愈來愈清楚，殼聚糖等生物性殺菌劑在一定程度上替代化學農藥將在農作物病害安全控制的領域中發揮重要作用。

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