生物活性物質殼寡糖對阿爾茨海默病防治作用研究進展

張 姣，戴雪伶，姜招峰*

(北京聯合大學 生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室，功能食品科學技術研究院，北京 100191)

殼聚糖(chitosan)是由甲殼素(chitin)經脫乙?；幚砻撊ゴ蟛糠忠阴；蟮玫降膭游锒嗵?。以殼聚糖為原料經水解后得到的低聚糖稱為殼寡糖(chitooligosaccharide，COS)，又稱甲殼低聚糖。殼寡糖是自然界唯一帶正電的堿性多糖，具有抗氧化、抑菌、抗糖尿病、抗腫瘤等多種生物活性作用[1-4]，其水溶性、人體吸收率、吸濕保濕性以及抗菌能力均優于殼聚糖，在保健食品開發方面具有較大的潛力和廣闊的前景。

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種與年齡相關的進行發展的中樞神經退行性疾病，又稱老年性癡呆。臨床表現為記憶能力不斷減退、認知能力不斷惡化，日常生活能力進行性衰退，同時伴有各種精神疾病癥狀和行為障礙。AD有3個典型的病理學特征：神經細胞大量凋亡，神經細胞內神經纖維纏結(neurofibrillar tangles，NFTs)以及神經細胞外老年斑(senile plaque，SP)的形成。AD研究發現，殼寡糖對神經細胞、Tau蛋白、β-分泌酶(β-secretase)、活性氧、二價銅離子、乙酰膽堿酯酶、血管緊張肽轉化酶以及腎素等均有一定的影響，對阿爾茨海默病的防治有著重要意義。本文結合阿爾海默茨病發病機制及殼寡糖特性，綜述殼寡糖對阿爾海默茨病的防治機制，旨在為殼寡糖在保健食品中的開發與利用提供一定的參考。

1 AD的發病機制

1.1 β-淀粉樣蛋白級聯假說

β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)是一種由39～43個氨基酸殘基組成的多肽，由淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)經β-分泌酶和γ-分泌酶裂解后形成。正常人體內的APP主要由α-分泌酶和γ-分泌酶通過非淀粉樣途徑降解為可溶性的sAPPα和不具有致病性的p83片段及羧基端片段；而AD患者腦中的APP主要由β-分泌酶和γ-分泌酶通過淀粉途徑降解為可溶的sAPPβ、Aβ和羧基端片段[5]。Aβ片段具有較強的自聚性，可通過寡聚化形成二聚體、三聚體、甚至更大的聚合體，最終轉化成不可溶的纖維狀聚合物，在細胞間沉積形成老年斑[6]。β-淀粉樣蛋白級聯假說由Hardy等[7]在1992年首次提出。該學說認為，當APP的代謝平衡被打破，引起Aβ的異常聚集，進而引起神經細胞內級聯病理反應，如突觸損傷、Tau蛋白的超級磷酸化、神經元死亡、神經元纖維纏繞等，導致記憶和認知功能障礙，產生AD癥狀。

1.2 自由基學說

與衰老有關的自由基主要是人體代謝過程中產生的，對于包括阿爾茨海默病在內的神經疾病有著重要影響。自由基攻擊生命大分子，如脂類、核糖核酸等，損傷細胞膜及細胞器，嚴重破壞神經元功能，最終造成其調亡。兩種脂質過氧化的產物4-羥基壬烯(4-hydroxynonenal，HNE)和2-丙烯醛(2-propenal)通過邁克爾加成反應與突觸蛋白的半胱氨酸、組氨酸和賴氨酸殘基共價結合，向蛋白質中引入羰基，使蛋白質發生氧化性修飾，造成蛋白質結構和功能的改變[8]。另外，有研究發現[9]，NT2神經元中氧化應激的增加可以使Aβ的表達增多。研究人員發現兩種經典的助氧化劑H2O2和FeSO4將導致NT2神經元細胞產生大量的HNE，進而使得Aβ在短時間內大量增加，對神經細胞產生毒性。

1.3 鈣離子穩態失調學說

鈣離子穩態失調學說認為，細胞內鈣離子水平持續紊亂是導致AD發生的一個關鍵因素，細胞外環境內流的鈣以及細胞內內質網儲存的鈣的調節控制著鈣信號，而神經元的許多功能依賴于鈣信號的轉導，鈣穩態失調對神經元長時程突觸增強效應有著較大影響，進而使得神經元突觸可塑性降低[10-11]。此外，鈣離子濃度與Aβ之間的正反饋機制，也促進著AD的發生與發展。鈣離子濃度的升高使得Aβ的產生增加，而Aβ又反過來影響鈣離子穩態，并形成惡性循環[11]。

1.4 炎癥反應學說

在AD患者大腦中，持續發現多種炎癥標記物，如包括α1-抗胰凝乳蛋白酶(alpha 1-antichymotrypsin)和C反應蛋白(C-reactive)在內的急性期蛋白、補體、激活的小膠質細胞和星型膠質細胞瘤細胞等[12]。其中，激活的小膠質細胞產生大量的炎癥因子，如白介素-6(interleukin-6，IL-6)、白介素-1(interleukin-1，IL-1)等；激活的星型膠質細胞包裹在SP周圍，在妨礙小膠質細胞對Aβ吞噬的同時，產生炎性物質，如前列腺素、IL-1等。炎癥反應學說認為，這些炎癥因子與炎癥相關的蛋白誘發神經炎癥反應并導致神經元的損傷與凋亡[13]。

1.5 其他學說

AD的發病機制遠不止上訴4種學說?；驅W說認為，目前發現的19號染色體上的載脂蛋白E基因(APOE基因)、14號染色體上的早老素1基因(PSEN1基因)，1號染色體上的早老素2基因(PSEN 2基因)、12號染色體上的α2巨球蛋白基因(A2M基因)等基因，對于AD的誘發起著直接或間接的作用，但機制目前尚不完全清除，有待進一步研究探索[14]。Tau蛋白異常磷酸化學說認為，AD腦中Tau蛋白發生過度磷酸化，聚集形成纏結，破壞組成神經細胞骨架結構的微管系統，各種營養運輸幾乎中斷，嚴重影響神經細胞的正常功能。鋁中毒學說認為，鋁介導Tau蛋白磷酸化，通過取代三磷酸鳥苷(GTP)結合位點上的鎂而影響微管聚合，促進NFT和SP的形成并聚集在NFT中[15]。膽堿能損傷學說認為，AD患者基底前腦區膽堿能神經元減少，重要神經遞質——乙酰膽堿(Ach)的合成、釋放和儲存減少，同時一些相關酶類如膽堿乙酰轉移酶(ChAT)、乙酰膽堿酯酶(AChE)的功能也發生不同程度的改變，進而引起一系列AD的臨床表現[16]。興奮性氨基酸學說認為，一些興奮性氨基酸尤其是谷氨酸(Glu)的快速興奮作用引起的去極化，使得Cl―、Na+及水內流，膜電位依賴式谷氨酸R(GluR)激活，進而引起細胞滲透性溶解和Ca2+大量內流，最終導致神經元受損[17]；另外，Glu的失調將使得Glu持續刺激N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)，引起大量鈣內流，導致興奮性毒性[18]?？傊珹D的發生不是一個單一因素影響的結果，而是一個多因素相互作用的復雜過程，其確切的發病機制還有待進一步的研究和探索。

2 殼寡糖對阿爾茨海默病的防治作用

2.1 對神經元細胞的保護及促進再生作用

神經元細胞大量凋亡是阿爾茨海默病的三大病理特征之一，其發生可能與神經突觸的大量丟失、Aβ的過度表達[19]、谷氨酸受體及鈣離子平衡失調[20]等諸多因素有關。Gong等[21]研究發現，將周圍神經受損的兔子分別靜脈注射殼寡糖1.5、3mg/kg后，周圍神經細胞的再生能力明顯較好，分別是空白對照組的1.6倍和2.4倍。Jiang等[22]用大鼠代替兔子進行上述實驗，得到了類似的結果，這說明殼寡糖對周圍神經細胞具有保護及促進再生的作用，且這種作用與劑量有量效關系。Yang等[23]研究了殼寡糖在體外對PC-12細胞神經元分化的影響，發現用殼寡糖處理后的PC-12細胞，其突觸生長和細胞活力均得到了增強，PC-12細胞神經絲H的mRNA(或蛋白)和鈣黏著蛋白的表達也被上調。谷氨酸鹽受體是興奮性毒損傷的主要參與者，可使細胞內鈣離子濃度升高，進而引發一系列不利于神經元的反應。Zhou Songlin等[24]研究發現，殼寡糖(分子質量800D)能保護海馬神經元免受谷氨酸鹽誘導的神經毒性的傷害。經一定濃度殼寡糖預先處理后，由谷氨酸鹽導致的海馬神經元凋亡有了一定程度的緩解；同時，因谷氨酸鹽引起的鈣離子濃度升高和半胱天蛋白酶-3(caspase-3)活性增強也受到了抑制，從而緩解了以上兩種原因導致的海馬神經元凋亡。

2.2 抑制β-分泌酶活性

β-分泌酶在阿爾茨海默病的發生和發展中起著重要作用，殼寡糖對β-分泌酶的抑制作用是治療AD的一個新靶點，對AD的防治有著重要意義。Byun等[25]發現幾種脫乙酰度和分子質量不同的殼寡糖，對β-分泌酶的活性均有一定的抑制作用，抑制強度與殼寡糖的脫乙酰度和分子質量有關。相同脫乙酰度的殼寡糖，中等分子質量的抑制效果最好；相同分子質量的殼寡糖，脫乙酰度越高的抑制效果越好，最后發現分子質量在3～5kD之間的90%脫乙酰度的殼寡糖(90-MMWCOS)顯示出了最高的β-分泌酶抑制活性，抑制劑的抑制模式為非競爭性抑制。

2.3 抑制Tau蛋白異常磷酸化

NFT是阿爾茨海默病的三大病理特征之一，其主要成分是Tau蛋白。正常情況下，Tau蛋白可以結合一定數量的磷酸分子；而在AD腦中，Tau蛋白則發生過度磷酸化，最終導致神經細胞的死亡。施美君等[26]研究了殼寡糖對岡田酸(OA)誘導的SD大鼠海馬神經元Tau蛋白過度磷酸化的抑制作用。將不同濃度殼寡糖預處理組與OA損傷組相比較，發現不同濃度殼寡糖預處理組神經元細胞形態均有所改善，部分細胞突起較OA損傷組明顯，細胞存活率均有所上升，細胞上清液中LDH含量均有所下降。同時還發現，殼寡糖預處理組各組的海馬神經元細胞Tau-pSer396陽性表達較OA損傷組均有所下降，并且以上各種改善均以殼寡糖質量濃度20μg/mL和40μg/mL效果最為明顯。說明殼寡糖能夠保護OA引起的SD大鼠海馬神經元細胞的損傷并抑制Tau蛋白的異常磷酸化。而這種抑制作用可能與殼寡糖的抗氧化作用有關，活性氧(ROS)引起的鈣穩態失調使得依賴性蛋白激酶和鈣調蛋白激酶激活，進而導致蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶比例失調，從而使得Tau蛋白傾向于異常磷酸化；此外，ROS亦能通過抑制能量代謝使得Tau蛋白激酶(TPK)的異構體——糖元合成激酶-3(GSK-3)代償性激活，進而也促進了Tau蛋白的異常磷酸化。殼寡糖清除ROS的作用，使得Tau蛋白異常磷酸化受到了抑制。

2.4 抗氧化作用

近年來研究發現，殼寡糖具有較好的抗氧化作用，可減少自由基的氧化損傷，從而對細胞起到保護作用。多項對殼寡糖在體外的抗氧化作用的研究表明，殼寡糖對羥自由基、超氧陰離子、H2O2、DPPH自由基等都有較好的清除能力，其原因可能是殼寡糖上的—NH2基團與自由基相結合，使自由基轉變為更穩定的物質，中止了鏈反應，而這種能力與多種因素相關。

Je等[27]發現殼寡糖的脫乙酰度和分子質量的大小對其清除自由基的能力強弱起到決定性作用，具有最強自由基清除能力的是最大脫乙酰度的中等分子質量的殼聚糖。李曉晶[28]發現殼寡糖清除DPPH自由基的能力隨著殼寡糖溶液質量濃度的增加而增強。張敬晗等[29]研究了殼聚糖及其衍生物、殼寡糖以及羧甲基殼聚糖清除羥自由基的能力，發現這些物質的抗氧化能力在一定質量濃度范圍內均隨質量濃度增加而增大，其中殼寡糖在質量濃度為0.32mg/mL時能達到97.81%的羥自由基清除率。Huang Ronghua等[30]發現低質量濃度的殼寡糖衍生物的自由基清除能力隨著其取代度的增加而降低，但高質量濃度的殼寡糖衍生物沒有發現取代度與抗氧化能力之間的關系。除取代度外，取代基團的性質對自由基清除能力也有一定影響。有研究發現[31]，殼寡糖清除ROS的能力與殼寡糖分子質量大小有關系，相比小分子質量的殼寡糖而言，中等分子質量的殼寡糖清除自由基的能力較強，其原因可能與溶解度有關。

而多項殼寡糖在體內的抗氧化作用研究也發現，殼寡糖對體內自由基代謝紊亂有改善作用，能使超氧化物歧化酶活力增加，丙二醛濃度減少[32-33]。張光等[34]發現，適當質量濃度的殼寡糖對兩種AD模型細胞——swe型和Δ9/swe型N2a細胞中活性氧的水平有明顯的抑制作用，分別在殼寡糖處理后48h和24h出現明顯抑制效果，達到較好抑制效果的殼寡糖濃度為0.1～1mg/mL。張吉等[35]研究了殼寡糖在細胞外對DPPH自由基、H2O2和羥自由基的清除作用以及對脂多糖誘導的N9小膠質細胞的保護作用，發現殼寡糖能有效清除DPPH自由基和羥自由基，但不能清除H2O2；同時發現其能降低脂多糖誘導的N9細胞培養液中NO水平，降低細胞內ROS水平，減少細胞凋亡，進而對N9小膠質細胞起到保護作用。

2.5 螯合銅離子

銅離子易與不同聚集形式的淀粉樣蛋白絡合形成復合物，并在老年斑內沉積。一方面，這種Aβ-Cu復合物具有一定的神經毒性，會在氧化應激過程中產生過氧化氫，促進Aβ沉積；另一方面，Aβ在催化反應循環中，也能使Cu(Ⅱ)還原為Cu(Ⅰ)，同時利用O2和生物還原劑作為底物催化產生過氧化氫，損害神經細胞。經研究發現，殼寡糖對銅離子有較好的吸附作用，并且這種吸附作用與殼寡糖的取代度、溶液pH值、溶液濃度和溫度等因素有關[36]。其機理可能是殼寡糖分子鏈中的羥基、氨基及其他活性基團可以形成網狀結構的籠形分子，對銅離子有較好的配位作用，能形成穩定的螯合物[37]。另外，Xu Wei等[38]前期研究發現，殼寡糖(分子質量1500D，脫乙酰度 90%)能有效地對抗大鼠皮質神經細胞中由二價銅離子引起的神經毒性，并且通過2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)檢測，發現殼寡糖能抑制二價銅離子引起的皮質神經細胞內活性氧水平的升高。

2.6 抑制乙酰膽堿酯酶、血管緊張肽轉化酶及腎素

殼寡糖具有抑制乙酰膽堿酯酶、血管緊張肽轉化酶及腎素的作用。乙酰膽堿酯酶是將腦內重要神經遞質——乙酰膽堿水解為膽堿和乙酸的水解酶，能抑制堿能神經元的活性，使腦內神經遞質出現紊亂。并且，乙酰膽堿酯酶與Aβ之間有相互促進表達的作用[39-40]。因而乙酰膽堿酯酶活性的抑制對AD的防治有重要意義。有研究發現[41]，幾種殼寡糖的衍生物——氨基殼寡糖、二甲基殼寡糖和二乙基殼寡糖對乙酰膽堿酯酶的活性均有抑制作用，且疏水性最強的二乙基殼寡糖抑制能力越大，可能與疏水相互作用有關。另有研究發現[42]，殼寡糖的脫乙酰度和分子質量與殼寡糖對乙酰膽堿酯酶的抑制能力也有關系，脫乙酰度較高、分子質量居中的殼寡糖效果較好。

血管緊張肽轉化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)是催化血管緊張肽Ⅰ轉化為血管緊張肽Ⅱ的一種酶，而腎素(renin)則可把緊張肽原轉變成血管緊張肽Ⅰ，這兩種物質的增加，不利于腦血管的擴張，會導致腦內流血量的減少，從而影響腦內新陳代謝，促進AD的發生與發展。研究發現[43-44]改性的N-乙?；鶜す烟?N-acetyl chitooligosaccharide，NA-COS)、氨基殼寡糖(aminoethyl chitooligosaccharide，AE-COS)對上述兩物質的活性有抑制作用，并且以脫乙酰程度達到90%，中等分子質量的殼寡糖效果為最佳。

3 結 語

阿爾海默茨病自1906年首次提出以來，已有一百多年的歷史，其致病機理及防治措施的研究一直受到各國學者的廣泛關注，隨著人口老齡化程度的加劇，患者家庭及社會的負擔越來越重，使得阿爾茨海默病更加受到重視。殼寡糖是唯一的帶正電荷的天然堿性寡糖，在自然界中來源廣泛，含量豐富，具有多種活性成分。隨著殼寡糖提取純化技術的不斷發展，殼寡糖活性作用研究日益成為熱點話題。我國保健食品正向著功效成分明確、作用機理清楚的第三代保健食品的方向發展，本文綜述殼寡糖在阿爾茨海默病的防治過程中所發揮的作用并簡要闡述其作用機制，旨在探索阿爾茨海默病的防治措施，同時為生物活性物質殼寡糖在保健食品中的深入利用提供一定的理論基礎。

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