外周血淋巴細胞亞群在慢性HBV感染過程中表達的變化分析

翁奉武，郭麗穎，李秋偉，李 力，趙立聰，孫小雪，尹美君，賈建偉

1 天津中醫(yī)藥大學 研究生學院，天津 301617；2 天津市第二人民醫(yī)院 中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合Ⅰ科，天津 300192

HBV感染是全球性的重大公共衛(wèi)生問題，HBV感染慢性化是發(fā)展為肝硬化和肝癌的主要危險因素[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，全世界約有2.57億人存在慢性HBV感染[2]，其中我國約有9300萬HBV感染者[3]。慢性HBV感染的臨床表現(xiàn)主要為肝炎-肝硬化-肝癌3個階段，不同階段的臨床特征各異。免疫功能是貫穿慢性HBV感染病程發(fā)展的一項重要因素。外周血淋巴細胞亞群數(shù)量的變化及功能特征可以有效反映機體的免疫狀態(tài)，慢性HBV感染者常伴隨淋巴細胞亞群功能失衡及紊亂，淋巴細胞免疫應答的特異性和強度顯著降低、功能耗竭，從而不能有效地識別和清除HBV，進而加重肝細胞損傷和炎癥反應[4-5]。本文將探討慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化、乙型肝炎肝硬化相關原發(fā)性肝癌患者外周血T淋巴細胞亞群、B淋巴細胞和自然殺傷細胞(NK細胞)的表達情況，從而揭示慢性HBV感染疾病進展過程中外周血淋巴細胞亞群的變化趨勢。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2018年1月-2019年4月在天津市第二人民醫(yī)院住院的慢性HBV感染患者，分為慢性乙型肝炎組、肝硬化組和肝癌組，所有患者ALT<2倍正常值上限(ULN)，TBil<1.5×ULN，高敏HBV DNA<20 IU/ml，肝功能Child-Pugh評分為A級，均已接受核苷(酸)類似物抗病毒治療，治療時間>6個月。選擇同期健康體檢者作為對照組。本研究經(jīng)由天津市第二人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批(批號：201818)，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 納入和排除標準 納入標準：符合慢性HBV感染所致的慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌的患者，其中慢性乙型肝炎、肝硬化診斷參考《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[6]；肝癌診斷參考中《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2017年版)》[7]。排除標準：(1)急性HBV感染者；(2)合并其他病毒(HAV、HCV、HIV等)感染者；(3)合并其他(脂肪性、酒精性、藥物性、自身免疫性等)慢性肝病患者；(4)繼發(fā)性肝癌或其他腫瘤患者；(5)合并嚴重感染、肝性腦病、消化道出血等并發(fā)癥患者；(6)妊娠及哺乳期婦女。

1.3 檢測方法

1.3.1 生化指標檢測 采用全自動生化分析儀(HITACHI 7180)檢測ALT、TBil水平。

1.3.2 高敏HBV DNA檢測 采用實時熒光定量PCR檢測儀(Roche COBAS AmpliPrep/ COBAS TaqMan)和配套試劑盒檢測HBV DNA載量。

1.3.3 外周血淋巴細胞亞群精準計數(shù)檢測 采集乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝外周血50 μl于絕對計數(shù)管(BD Trucount管)中，加入相應的CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD16+CD56+20 μl熒光標記流式抗體(BD Multitest試劑)，混勻，室溫避光放置20 min。再加入450 μl溶血素(BD FACS溶解液)，混勻，室溫避光放置20 min，采用流式細胞術(shù)(BD FACSCanto流式細胞儀)檢測外周血淋巴細胞亞群精準計數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學方法 使用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的計量資料以±s表示，組間方差不齊采用Welch方差分析，兩兩比較采用Games-Howell檢驗。非正態(tài)分布的計量資料以M(P25～P75)表示，多組間及進一步兩兩比較采用Kruskal-WallisH檢驗。計數(shù)資料組間比較采用χ2秩相關分析法。相關性分析采用Spearman秩相關分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共納入慢性HBV感染患者132例，其中男88例，女44例，年齡23～79歲，平均年齡(52.30±12.05)歲；慢性乙型肝炎組47例，肝硬化組44例，肝癌組41例。健康體檢者42例，其中男20例，女22例，年齡21～79歲，平均年齡(51.48±15.83)歲。4組性別、年齡、ALT、TBil水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)(表1)，具有可比性。

表1 4組性別、年齡和肝功能指標比較

2.2 4組外周血T淋巴細胞亞群表達情況 慢性HBV感染患者外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+T淋巴細胞在對照組、慢性乙型肝炎組、肝硬化組和肝癌組中比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。與對照組和慢性乙型肝炎組相比，肝硬化組和肝癌組CD3+、CD4+T淋巴細胞數(shù)量明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。與對照組相比，肝癌組CD8+T淋巴細胞數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與慢性乙型肝炎組相比，肝硬化組和肝癌組CD8+T淋巴細胞數(shù)量明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)(表2)。

表2 4組外周血T淋巴細胞亞群精準計數(shù)比較

注：與對照組比較，1)P<0.05；與慢性乙型肝炎組比較，2)P<0.05。

2.3 4組外周血B淋巴細胞表達情況 慢性HBV感染患者外周血CD19+B淋巴細胞在對照組、慢性乙型肝炎組、肝硬化組和肝癌組中比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。與對照組和慢性乙型肝炎組相比，肝硬化組和肝癌組CD19+B淋巴細胞數(shù)量明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)(表3)。

表3 4組外周血B淋巴細胞精準計數(shù)比較

注：與對照組比較，1)P<0.05；與慢性乙型肝炎組比較，2)P<0.05。

2.4 4組外周血NK細胞表達情況 慢性HBV感染患者外周血CD16+CD56+NK細胞在對照組、慢性乙型肝炎組、肝硬化組和肝癌組中比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。與對照組相比，肝硬化組和肝癌組CD16+CD56+NK細胞數(shù)量明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)；與慢性乙型肝炎組比較，肝癌組CD16+CD56+NK細胞數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表4)。

表4 4組外周血NK細胞精準計數(shù)比較

注：與對照組比較，1)P<0.05；與慢性乙型肝炎組比較，2)P<0.05。

2.5 不同疾病狀態(tài)與外周血淋巴細胞亞群相關性分析

Spearman相關性分析結(jié)果顯示，4組疾病進展與外周血CD3+T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、CD19+B淋巴細胞、CD16+CD56+NK細胞呈明顯負相關(r值分別為-0.414、-0.503、-0.269、-0.435、-0.402，P值均<0.01)。其中CD4-+T淋巴細胞與疾病進展的相關性最大(r=-0.503)。

3 討論

HBV感染過程中，免疫功能健全者有機會憑借自身機體免疫反應將病毒清除而痊愈，而絕大多數(shù)患者為母嬰或父嬰垂直傳播而來，可能存在一定的免疫缺陷，不能完全清除病毒，病情將持續(xù)緩慢進展。先天免疫系統(tǒng)是機體抵御病毒感染的一線防御機制，受感染的肝細胞和肝內(nèi)固有免疫細胞識別病毒，誘導直接抗病毒機制，并進一步調(diào)節(jié)先天性和適應性免疫應答[8]。宿主的免疫反應不足被認為是導致慢性HBV感染的關鍵因素[9]，因此免疫功能在慢性HBV感染的發(fā)生和進展中發(fā)揮著重要作用。

淋巴細胞是機體免疫系統(tǒng)的重要細胞成分，主要包括T淋巴細胞(CD3+)、B淋巴細胞(CD19+)和NK細胞(CD16+CD56+)。其中NK細胞執(zhí)行先天性免疫反應，T淋巴細胞和B淋巴細胞執(zhí)行適應性免疫反應。先天性免疫控制對病毒感染的最初反應，而特定的細胞免疫和體液免疫則消除病原體和防止再感染[10]。T淋巴細胞主導機體細胞免疫，具有抵抗病毒和調(diào)節(jié)免疫功能的作用。CD3+T淋巴細胞代表總成熟T淋巴細胞，反應機體細胞免疫功能狀態(tài)；CD4+T淋巴細胞是輔助性T淋巴細胞(Th)，介導遲發(fā)性超敏反應，協(xié)助B淋巴細胞和細胞毒性T淋巴細胞行使免疫應答功能，是免疫應答中清除病毒的重要細胞；CD8+T淋巴細胞是細胞毒性T淋巴細胞(Tc)，在免疫反應中直接與靶細胞結(jié)合釋放顆粒酶和穿孔素而殺傷靶細胞，是引起病毒感染后肝細胞損傷的主要細胞[11]。正常情況下，CD4+、CD8+T淋巴細胞互相拮抗保持平衡，HBV感染后，Tc迅速增殖分化，當比例失衡，免疫功能則發(fā)生紊亂[12-14]。B淋巴細胞是主導機體體液免疫的關鍵細胞，通過產(chǎn)生高親和力病毒特異性抗體，以中和病毒[15]。NK細胞主導某些腫瘤細胞和病毒感染細胞無需預先致敏的細胞毒性作用，是機體在免疫應答中抗腫瘤、抗病毒感染以及免疫監(jiān)控的重要因素，在機體清除HBV的過程中起到了不可或缺的作用[16]。

本研究檢測了132例慢性HBV感染者以及42例健康者的外周血T淋巴細胞亞群、B淋巴細胞和NK細胞的表達水平，結(jié)果顯示，肝硬化組和肝癌組CD3+T淋巴細胞數(shù)量與對照組和慢性乙型肝炎組相比明顯減少，且隨著慢性HBV感染的加重，即從慢性乙型肝炎-肝硬化-肝癌的過程中，CD3+T淋巴細胞數(shù)量逐漸減少，提示T淋巴細胞亞群和疾病的進展有著密切關系；肝硬化組和肝癌組CD4+T淋巴細胞數(shù)量減少提示在慢性HBV感染過程中，機體內(nèi)CD4+T淋巴細胞免疫功能降低，導致HBV不易被清除，進一步導致感染的加重。肝癌組CD8+T淋巴細胞數(shù)量減少，提示肝癌患者抗腫瘤效應明顯較低。劉恩惠等[17]通過對慢性HBV感染者不同病理狀態(tài)外周血淋巴細胞亞群變化的研究發(fā)現(xiàn)，炎癥程度≥G2組CD8+T淋巴細胞水平低于

綜上所述，慢性HBV感染患者機體免疫功能降低，介導免疫反應的免疫活性細胞數(shù)量減少，無法有效清除體內(nèi)病毒，造成肝細胞持續(xù)損傷，從而使病情進一步發(fā)展。本研究基于外周血T淋巴細胞亞群、B淋巴細胞和NK細胞的表達情況，發(fā)現(xiàn)免疫細胞在慢性HBV感染發(fā)生進展和預后中的重要作用，認識到提升外周血淋巴細胞亞群的狀態(tài)對于預防和治療慢性HBV感染具有重要意義。