以肝星狀細胞為靶向的藥物載體系統

黃小莉，劉瑩瑩，叢 敏

首都醫科大學附屬北京友誼醫院 肝病中心，肝硬化轉化醫學北京市重點實驗室，北京 100050

肝纖維化是長期慢性肝損傷導致的持續損傷修復的過程，以細胞外基質(ECM)在肝內過度沉積，肝內結締組織異常增生為主要特征。肝星狀細胞(HSC)的活化是肝纖維化的關鍵因素。在正常肝臟中，HSC處于靜止狀態(qHSC)，是儲存維生素A和類視黃醇的主要細胞。當炎癥或機械刺激損傷肝組織時，肝細胞、活化的Kupffer細胞和單核細胞衍生的巨噬細胞釋放大量可溶性介質，包括TGFβ、血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)、TNF等[1-2]，誘導HSC由靜止表型向具有高度增殖性、收縮性、遷移性的肌成纖維細胞表型分化。活化后的HSC(aHSC)維生素A脂滴消失，分泌大量的ECM和基質金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)，肝臟中ECM的組成從Ⅳ型膠原轉變為Ⅰ型和Ⅲ型膠原，ECM的合成和降解失衡，異常膠原纖維沉積增加，促進肝纖維化的發展。aHSC還通過自分泌和旁分泌各種細胞因子和趨化因子，與肝臟中其他細胞相互作用，維持甚至加強肝纖維化，從而顯著促進疾病的進展。因此，aHSC是肝纖維化藥物干預治療的重要靶點,如何安全有效地將治療藥物靶向遞送至HSC，提高藥物療效，減小藥物脫靶的毒副作用，是目前抗肝纖維化藥物開發的重要策略。

1 HSC特異性受體靶向性抗纖維化藥物

在aHSC表面過表達多種受體，包括甘露糖-6-磷酸/胰島素樣(mannose-6-phosphate/insulin like growth factor Ⅱ，M6P/IGF Ⅱ)受體、血小板衍生生長因子受體(platelet-derived growth factor receptors，PDGFR)、成纖維細胞生長因子誘導的早期反應蛋白-14(fibroblast growth factor inducible 14, Fn14)、趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4, CXCR4)、視黃醇結合蛋白(retinol-binding protein，RBP)受體和Ⅵ型膠原蛋白受體(collagen type Ⅵ receptor，CVIR)等，利用這些受體構建特異性靶向HSC的抗纖維化藥物是目前常用的策略。

1.1 靶向M6P/IGF Ⅱ受體 M6P/IGF Ⅱ受體是最常用的靶向受體，其在aHSC表面高表達且可與三種配體結合，即IGF-Ⅱ、攜帶M6P的蛋白和視黃酸。一個M6P/IGF Ⅱ受體可以結合一個IGF Ⅱ配體和兩個M6P配體[3-4]，M6P/IGF Ⅱ受體具有多種生物學功能，包括溶酶體蛋白分選和生長調節作用。正常肝臟中，qHSC表達很少的M6P/IGF Ⅱ受體，但在肝纖維化期間，aHSC膜表面的M6P/IGF Ⅱ受體表達上調。1999年，Beljaars等[5]首先證明用人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)修飾的M6P(M6P-HSA)可以被aHSC攝取，且當M6P與HSA以28∶1的比例偶聯時，其在纖維化大鼠肝臟中的聚集可以達到注射量的59.2%±9.2%，且肝內蓄積的M6P-HSA優先被HSC攝取(70%±11%)。因此這種新型載體被廣泛應用于向aHSC靶向遞送抗纖維化藥物。許多研究[6-8]利用該系統成功地將激酶抑制劑、受體阻斷劑、脂質體和細胞因子靶向遞送至動物和人HSC。van Beuge等[9]合成TGFβ Ⅰ型受體(ALK5)抑制劑(LY-364947)與M6P-HSA偶聯的復合物，該復合物特異性靶向HSC，抑制TGFβ調控的Smad信號通路，進而抑制HSC的活化和膠原蛋白的沉積，具有一定的抗纖維化作用。同時，由于M6P-HSA的靶向作用，可以減少ALK5在其他肝細胞中對TGFβ信號的干擾，進而減少毒副作用。此外，還有研究小組證明牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)修飾的M6P(BSA-M6P)也可以增加M6P對aHSC的靶向性[10]。其利用BSA-M6P與可形成三聚體的寡核苷酸(triplex-forming oligonucleotides，TFO)結合形成BSA-M6P-TFO復合物，通過TFO與Ⅰ型膠原啟動子上的特定序列結合抑制膠原基因的表達。但是由于BSA的高分子量，重復注射高劑量的M6P-BSA-TFO治療肝纖維化或具有免疫原性。因此，該實驗組隨后使用N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺[N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide，HPMA)共聚物代替BSA，通過組織蛋白酶B響應短肽GFLG與TFO偶聯形成M6P- HPMA -TFO復合物以消除BSA的免疫原性[11]。有課題組[12-13]利用噬菌體展示技術合成Peptide-431，對人和大鼠HSC上表達的IGF Ⅱ受體表現出高度特異性，并成功利用Peptide-431將抗纖維化藥物靶向遞送至aHSC ，抑制纖維化發展。另外，Chen等[14]利用指數富集的配體系統進化技術篩選出M6P/IGF Ⅱ受體特異性核酸適配體，該特異性核酸適配體通過退火與siRNA形成嵌合體，該嵌合體對人和大鼠HSC具有高親和力和特異性，且在CCl4誘導的大鼠肝纖維化模型中，顯示出較高的肝臟攝取效能，作為抗肝纖維化治療的靶向載體具有巨大的潛力。

1.2 靶向PDGFR PDGFR由α和β兩個亞單位構成，qHSC表面只表達α亞單位，aHSC同時表達α亞單位和β亞單位，且以β亞單位為主[15]。PDGFRβ可通過ERK、AKT和核因子-κB(NF-κB)途徑增強HSC對化學損傷的炎癥和纖維化反應，是參與HSC增殖和活化的重要介質[16]。PDGF作為PDGFR的天然配體，由A鏈和B鏈組成。兩條鏈形成的二聚體有三種構型，即AA、AB或BB。 PDGFRα以高親和力結合A鏈和B鏈，而PDGFRβ僅結合B鏈。其中PDGF-B鏈中的精氨酸和異亮氨酸殘基是結合PDGFR的重要位點[17]。基于此，人工合成的含有這兩個重要氨基酸殘基的環肽pPB(C*SRNLIDC*, C*表示環化半胱氨酸殘基)同樣具有PDGFRβ的親和力，利用該環肽修飾的白蛋白(pPB-HSA)可特異性結合aHSC表面的PDGFRβ，且通過對PDGF-BB的拮抗作用，在一定程度上抑制PDGF-BB誘導的HSC細胞增殖，具有抗纖維化作用[18]。然而，PDGFRβ是結合同源/異源二聚體PDGF的二聚體蛋白質。因此，需要兩個pPB分子以實現與PDGFRβ的結合。Bansal等[19]將單環肽pPB改造成雙環肽pPB(BiPPB)，使其能與二聚體PDGFR相結合。利用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)分別標記pPB和BiPPB。結果顯示，FITC標記的BiPPB與大鼠原代HSC和人肌成纖維細胞的PDGFRβ特異性結合，而在FITC標記的單環pPB中未觀察到特異性結合，表明通過PDGFRβ識別HSC需要二聚體的相互結合。值得注意的是，在肝硬化患者中常伴有急性腎損傷，對肝硬化的發展和預后有重要影響[20]。在肝硬化大鼠中，腎臟內的PDGFR表達也發生上調。Klein等[21]利用pPB-HSA偶聯Rho激酶抑制劑Y-27632(Y27-pPB-HSA)，在膽總管結扎(bile duct ligation，BDL)和CCl4誘導的肝纖維化中發現，Y27-pPB-HSA顯著降低肝硬化大鼠的門靜脈壓力和肝血管阻力，但對全身血管阻力無顯著影響。且Y27-pPB-HSA可以特異識別腎臟中的PDGFRβ，改善腎灌注，顯示出良好的抗肝纖維化和減輕腎損傷作用。

1.3 靶向Fn14 Fn14屬于TNF受體家族的細胞表面受體，與幾種細胞內信號傳導途徑相關，涉及MAPK和NF-κB途徑。在aHSC中Fn14的表達顯著上調，Fn14可通過直接影響HSC的增殖和衰老促進纖維化的進展[22-23]。利用合適的Fn14配體特異性靶向HSC是可行的抗纖維化策略。D對映體肽對蛋白酶水解具有抗性，且與親本肽保持相似的生物學活性，作為生物穩定的靶向分子受到越來越多的關注。Huang等[24]通過鏡像mRNA展示技術篩選得到能特異性結合Fn14的D-配體肽 (D-FNB肽)。通過小鼠體內成像測定，與聚乙二醇(PEG)修飾的脂質體相比，D-FNB肽修飾的脂質體在正常和CCl4處理的模型小鼠肝臟中顯示出更強、更持久的熒光信號，這在一定程度上表明，D-FNB肽修飾的脂質體可以通過特異性靶向HSC而避免肝臟中的單核吞噬細胞系統對脂質體的非特異性攝取。

1.4 靶向CXCR4 CXCR4是基質細胞衍生因子1(stromal cell derived factor-1, SDF-1)特異性受體，在慢性肝病和肝纖維化發生發展過程中發揮重要作用。在慢性 HCV和HBV感染伴有炎癥和纖維化患者中，SDF-1/CXCR4的表達隨肝纖維化的嚴重程度而增加[25]。SDF-1與HSC上的CXCR4結合后，通過ERK 1/2和PI3K-Akt途徑誘導HSC增殖和Ⅰ型膠原蛋白的產生[26]。同時SDF-1以非鈣離子依賴的方式作用于CXCR4促進HSC的收縮[27]。考慮到aHSC在肝纖維化進展的作用，特異性靶向CXCR4可能發揮抗纖維化作用。但是，在CCl4誘導的小鼠肝纖維化模型中，AMD3100(CXCR4拮抗劑)的治療加重了肝臟炎癥和纖維化，伴隨肝內中性粒細胞增加[28]。另一CXCR4拮抗劑AMD070同樣并未減輕小鼠CCl4模型中的肝纖維化[29],進一步驗證了上述發現。研究[30-31]發現SDF-1/CXCR4途徑對于從骨髓募集干細胞到肝損傷部位以幫助組織再生具有重要作用，這可能部分解釋了單純阻斷SDF-1/CXCR4軸并不能改善肝纖維化的現象。有研究[32]表明，利用AMD3100修飾的納米顆粒將血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的siRNA靶向遞送至纖維化肝臟可發揮顯著的抗纖維作用，其一方面通過AMD3100靶向aHSC抑制HSC的增殖和活化，另一方面通過下調VEGF的表達，抑制血管生成并促進纖維化肝臟中變形的血管正常化。索拉非尼是一種靶向RAF/MEK/ERK途徑和PDGFR/VEGFR的多激酶抑制劑，可抑制HSC的增殖和活化以及血管生成，為該藥物提供抗纖維化的可能。但是Sung等[33]研究發現索拉非尼可以通過誘導ERK的反常激活、NF-κB活化，誘導HSC活化，限制其抗纖維化的活性。因此，該研究小組通過將索拉非尼和MEK抑制劑(AZD6244)聯用，并將兩者包裹在AMD3100修飾的納米材料中，選擇性靶向aHSC，通過抑制HSC中的ERK和NF-κB活化，實現協同的抗纖維化效果。另一研究小組，運用CXCR4靶向脂質體共同遞送吡非尼酮和AMD3100，通過促進活化的HSC凋亡，發揮抗纖維化作用[34]。

1.5 靶向RBP 受體 HSC是維生素A(視黃醇)的主要攝取和儲存細胞，體內50%～80%的維生素A以視黃醇棕櫚酸酯的形式存在于HSC胞質的脂滴中[35]，血液中的視黃醇與RBP結合形成視黃醇-RBP復合物，通過HSC膜上的RBP受體轉移到HSC內并儲存在細胞質脂滴中[36]。作為HSC的天然配體，維生素A和RBP被廣泛研究應用于HSC的靶向載體。熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)47，參與前膠原合成并促進膠原分泌，Sato等[37]將針對大鼠gp46(HSP47同源蛋白)的siRNA 包裹在偶聯維生素A的脂質體中(lip-siRNAgp46)，將siRNAgp46靶向遞送至HSC，抑制HSC膠原的分泌，逆轉CCl4和BDL誘導的大鼠肝纖維化。這是證明siRNA在動物模型中具有治療潛力的早期研究之一。研究[38]表明，白蛋白可直接參與含維生素A的脂滴的形成，從而使HSC失活。研究人員將白蛋白結構域Ⅲ與RBP構建了重組融合蛋白——R-Ⅲ，其利用RBP將白蛋白結構域Ⅲ靶向遞送至HSC，使aHSC向靜止表型轉變，減輕CCl4和BDL誘導的肝纖維化[38-39]。

1.6 靶向CVIR CVI是一種大的ECM分子，可通過與細胞和其他基質分子的相互作用刺激細胞生長，促進細胞存活，調節基質穩態[40]。活化的HSC上CVIR表達增加，因此CVIR被開發用于抗纖維化藥物的靶向遞送受體。環狀RGD肽-C*GRGDSPC*可以和CVIR特異性結合而被用于修飾HSC靶向藥物遞送的特定載體。用環狀RGD肽修飾的HSA(pCVI-HSA)體內實驗[41]證實，其在肝臟內大量累積，優先結合于活化的HSC并內化進入胞內。同時，pCVI-HSA具有內在活性，可阻斷天然CVI的細胞結合位點而干擾HSC活化過程。除此之外，聚合物囊泡(PM)與抗纖維化藥物氧化苦參堿(OM)結合后再經前述RGD修飾獲得RGD-PM-OM，其在體外抑制HSC的增殖，降低α-SMA和膠原蛋白的表達，同時減少BDL誘導大鼠肝纖維化中膠原的沉積[42]。另一實驗室，通過用賴氨酸替換半胱氨酸來改變前述肽(C*GRGDSPC*)的序列，合成環狀C*GAGASPK*肽，新環狀肽通過賴氨酸和半胱氨酸殘基之間形成肽鍵環化，具有更好的穩定性。新環狀RGD肽與包裹IFNα的脂質體連接，特異性識別并結合HSC表面的CVIR。在BDL誘導的肝纖維化大鼠中，新環狀RGD肽偶聯脂質體在HSC中的累積量是未修飾脂質體的10倍，表現出更好的抗纖維化效果[43]。

2 非病毒載體的HSC靶向治療

非病毒載體具有安全性高、免疫原性低、易于制備等優點，具有重要的潛在臨床應用價值。目前研究較多的抗纖維化藥物靶向遞送系統有脂質體遞送系統、無機納米粒遞送系統和納米膠束載藥系統等。

2.1 脂質體遞送系統 脂質體是以疏水性脂質雙層為其外膜的球形載體，可將藥物等親水性或疏水性物質包裹其中。自1964年Bangham首次發現后，脂質體成為醫學領域中最有前景的藥物靶向載體之一。脂質體的脂質雙層可與其他雙層融合，例如細胞膜，促進其內容物(如藥物)的釋放，使其可用于藥物遞送應用。脂質體對肝臟具有天然的靶向性，且主要被單核吞噬細胞系統吞噬代謝[44]。為了減少單核巨噬細胞系統的攝取，可以通過脂質體表面裝飾惰性、生物相容的親水聚合物，如神經節苷脂GM1，磷脂酰肌醇、PEG或二亞油酰磷脂酰膽堿。這些聚合物通過在脂質體表面上形成親水性保護層，在空間上阻礙血清調理素與脂質體表面的附著，延緩脂質體的全身清除，提高脂質體的藥代動力學[45-48]。El-Mezayen等[49]利用2,3-二油氧基丙基三甲基氯化銨(2, 3- dioleoyloxy- propyl-trimethylammonium，DOTAP)修飾脂質體，使其成為陽離子脂質體，有效逃避單核巨噬細胞系統對其攝取。同時通過DOTAP修飾后的脂質體將伊馬替尼和維生素A偶聯形成可以特異性靶向HSC的復合物，通過雙重抑制PDGF和TGFβ信號通路，從而逆轉纖維化。肉蓯蓉是一種傳統中草藥，其含有的活性成分苯乙醇糖苷(phenylethanol glycosides, CPhGs)可以通過阻斷TGFβ1/ Smad信號通路的傳導，抑制HSC的活化，發揮抗肝纖維化作用。Zhang等[50]合成脂質體包裹的CPhGs，增加了CPhGs的穩定性和生物利用率，通過促進HSC的凋亡和調節HSC的細胞周期，抑制HSC的活化，從而抑制肝纖維化的發展。

2.2 無機納米粒載藥系統 根據材料來源的不同，可以將無機納米粒子分為二氧化硅(SiO2)、二氧化鈦(TiO2)、碳納米材料等非金屬類材料以及磁性鐵、銀、金納米粒子等金屬類材料。這些納米粒子載體藥物在抗纖維化效果中各有特點。研究[51]發現SiO2納米顆粒和TiO2納米顆粒由于其超小的尺寸和帶電性質可具有與納米藥物相似的性質，具有內在的抗纖維化特性，其顯著抑制TGFβ對HSC的活化作用，抑制Ⅰ型膠原和α-SMA的表達；同時通過上調MMPs和下調TIMPs來促進膠原蛋白的分解，抑制HSC的黏附和遷移，使它們恢復到更靜止的狀態。盡管治療效果前景可觀，但也有報道[52]稱無機納米粒的暴露會增加有害生物分子在體內的積聚，使人體產生氧化應激和炎癥反應。另有文獻[53]報道SiO2納米顆粒在體內具有促纖維化的作用，SiO2納米顆粒可促進脂質過氧化物水平的增加和肝臟中抗氧化酶活性的降低，激活TGFβ1/Smad3信號通路，誘導肝纖維化。同時，某些無機納米粒子通過炎癥小體介導急性肝臟炎癥反應[54]。總體而言，氧化應激的產生會對各種細胞造成損害，在無機納米粒子治療肝纖維化時必須考慮相對的風險和益處。

2.3 納米膠束載藥系統 納米膠束，是由內部疏水核心和外部親水殼組成的納米級大小的核-殼型膠束。其中疏水核心可以裝載水溶性差的藥物，以增加其生物利用度，延長血液半衰期，降低非特異性相互作用和毒性；外部親水性殼可以修飾不同的官能團，例如葉酸、單克隆抗體和單糖(甘露糖、葡萄糖、果糖)等，實現主動靶向和(或)pH/溫度響應給藥[55-56]。刺激響應性藥物釋放是納米膠束載藥的主要優點之一。Wu等[57]合成pH敏感性納米膠束負載治療藥物miRNA-29b和miRNA-122，同時將維生素A偶聯納米膠束。裝載有miRNA-29b和miRNA-122的膠束通過維生素A靶向遞送至HSC中，并通過pH敏感性響應使其在酸性溶酶體內快速釋放，實現miRNA-29b和miRNA-122協同的抗纖維化作用。與其優點相比，納米膠束載藥系統也有許多挑戰，如納米膠束的小尺寸限制其內部藥物的負載，同時納米膠束的長期穩定性也受到質疑[58]。

3 小結

HSC是肝纖維化治療的重要靶點，將抗纖維化藥物靶向遞送至HSC，減少藥物非特異性作用引起的副作用，是目前抗纖維化藥物開發的重要策略。如前所述，許多蛋白質標志物包括M6P/IGF Ⅱ受體、PDGFR、Fn14、CXCR4、RBP receptor和CVIR等在aHSC中過表達，且大多數研究者關注上述受體的天然配體為載體靶向遞送抗纖維化藥物，但是天然配體存在低生物相容性、低特異性、高毒性和尺寸較大等局限，這是在使用天然配體特異性遞送藥物需要克服的問題。基于天然配體，人工合成改造的仿生肽具有體積小，易于生產，高穩定性、高特異性、高親和力、非免疫原性等特點，在抗纖維化藥物靶向遞送中有可觀的應用前景[59]。目前已有的幾種HSC靶向給藥系統或是基于病毒載體或是非病毒載體。病毒載體具有較高的感染率，但是如何更有效的靶向HSC，減少非特異性吸收，以及存在的如宿主免疫反應性等安全問題，均亟需解決。相反，非病毒載體具有安全性高、免疫原性低、易于制備等優點，成為近年來藥物遞送載體關注的焦點，但非病毒載體藥物負載率低、具有潛在的細胞毒性等是其治療應用的局限性。因此盡管已經開發了許多靶向遞送系統來治療肝纖維化，但是需要對這些遞送系統進一步優化，達到更高的抗纖維化效果和低的毒副作用。