中性粒細胞胞外誘捕網的形成機制及在肝病中的作用

曹 林，李 茜，紀龍珊，高月求,2，李 曼

1 上海市中醫臨床重點實驗室 細胞免疫學實驗室，上海 200120；2 上海中醫藥大學附屬曙光醫院 肝病科，上海 200120

中性粒細胞是外周血中最豐富的白細胞，在先天免疫系統中扮演著重要角色，是機體應對病原體入侵時的第一道防線[1]，除了通過胞吞作用吞噬病原微生物、釋放嗜天青顆粒及產生并分泌顆粒狀抗菌分子外，還具有抵抗微生物入侵的新機制—中性粒細胞細胞外誘捕網(neutrophil extracellular traps，NETs)的形成[2-3]。近年來的報道[4]表明，NETs可能在包括系統性紅斑狼瘡、類風濕關節炎、糖尿病、血管炎等非傳染性的疾病中發揮作用。本文主要闡述NETs的形成機制、結構組成及其在肝病中的最新研究進展。

1 NETs的形成機制

1996年，Takei等[5]用佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)刺激中性粒細胞時觀察到其特殊的形態學變化，直至2004年Brinkmann等[6]經過驗證并將其命名為NETs。NETs的形成不同于細胞的凋亡與壞死[7]，迄今為止，人們提出的NETs釋放的機制包括：早期非溶解性NETs和晚期溶解性NETs[8]，兩者是多種不同受體[Toll樣受體(TLR)、Fc受體和補體受體等]通過識別無菌性和(或)感染性刺激導致中性粒細胞活化的結果。對前者而言，中性粒細胞通常被白色念珠菌、金黃色葡萄球菌等激活后的5～60 min即可釋放NETs，這一過程不依賴于還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶復合物產生的活性氧(ROS)[9]，主要表現為：當TLR或某些菌株存在時，直接刺激血小板通過淋巴細胞關聯抗原1與中性粒細胞結合，引起肽基精氨酸脫氨酶(peptidylarginine deiminase，PAD)4的活化，促進染色體解聚及中性粒細胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)易位入胞核，隨后經蛋白修飾的染色質通過核膜泡化和囊泡排出胞外，形成NETs，胞膜保持完整，細胞仍保持原有活力[8]。在晚期溶解性NETs中，膽固醇、PMA、IL-8、內毒素、Fc受體[10]和A類清道夫受體[11]等作用于中性粒細胞后的1～4 h即可形成NETs，在此過程中，內質網中的Ca2+進入胞質，使得RAF-MEK-MAPK通路或蛋白激酶C 被活化，導致NADPH氧化酶復合物產生ROS及激活PAD4，加速組蛋白的高聚亞氨酸化，促進染色質去濃縮。髓過氧化酶(myeloperoxidase，MPO)是NADPH氧化酶下游的一種酶，隨之儲存在中性粒細胞顆粒中的MPO和NE，轉移到細胞核，促進染色質進一步展開，核膜解體，核內容物與胞質中的顆粒蛋白混合，胞膜破裂，以DNA為基礎的混合物溢出到細胞外，最終細胞死亡，釋放NETs[12-13]。

2 NETs的結構組成

NETs是一個以DNA為骨架的纖維網狀結構，上面裝飾著各種各樣的直徑為25～50 nm不等的球形蛋白結構域[13-14]。目前，蛋白質組學分析已檢測到NETs中有多達80種蛋白質，其中，纖維網狀結構是NETs發揮主要功能的物質，包括去濃縮的染色質和組蛋白，組蛋白約占所有與NETs連接的蛋白的70%，后者除了包含MPO、NE外，還含有如組織蛋白酶G、防御素、殺菌/通透性增強性蛋白[15]、乳鐵蛋白、脂質運載蛋白2[16]、溶菌酶、抗菌肽、膠原酶等來源于中性粒細胞不同細胞器的蛋白,以及蛋白酶3、類胰蛋白酶、抗菌肽LL-37[17]等胞漿蛋白[1,18]。

3 NETs在肝病中的研究進展

3.1 無菌性炎癥肝臟疾病 非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是一種伴隨有炎癥及肝細胞損傷的脂肪肝疾病，是發展成肝癌的危險因素。研究[19]發現NASH患者血清中NETs標志物(MPO-DNA)的表達升高；經DNase治療或敲除PAD4基因的STAM模型(又稱NASH-HCC模型)小鼠，發現NETs的形成減少，不影響肝內脂肪變性和游離脂肪酸的積累，但可防止巨噬細胞浸潤，并將炎癥環境改變為不利于肝癌生長的環境，腫瘤生長得到抑制，從而降低NASH向肝癌發展的風險。

肝缺血再灌注損傷(hepatic ischemia and reperfusion injury，IRI)是肝外科疾病中常見的病理過程。肝臟恢復血液供應后招募大量中性粒細胞浸潤，受損的肝細胞釋放高遷移率族蛋白1和組蛋白等損傷相關的分子模式識別受體通過TLR4/9信號通路介導中性粒細胞產生NETs，進一步增加肝細胞死亡，NETs還可以誘導Kupffer細胞釋放IL-6、TNFα和CXCL-10等炎癥因子和趨化因子以促進疾病的發展，加重損傷[20]。動物實驗發現，小鼠缺血再灌注的損傷后，受損肝臟中的NETs表達升高，Sergio的團隊[21]在肝臟特異性甲狀腺素結合球蛋白的驅動下，構建了重組腺病毒8型載體(AAV8)，用于編碼小鼠體內的基質金屬蛋白酶-1的組織抑制劑(TIMP-1)，發現經rAAV8-TIMP-1載體處理的C57BL/6小鼠肝臟中TIMP-1選擇性過表達，過表達的TIMP-1會抑制NETs的形成，對肝IRI有保護作用；Suyavaran的團隊[22]發現，分別應用NADPH氧化酶2(NOX2)和p38 MAPK信號通路的抑制劑羅布麻苷和柚皮苷提前干預，可見NETs的釋放、炎癥因子及p38 MAPK的活化受到明顯的抑制，提示NOX2、p38MAPK信號通路的抑制劑及TIMP-1在將來可能作為改善IRI患者的有效治療藥物。

3.2 慢性乙型肝炎(CHB)、肝硬化 CHB是HBV感染后，以炎性細胞浸潤為主的病程漫長的、病情遷延反復、難以治愈的一種慢性病變[23]。HBV會影響中性粒細胞的功能而抑制NETs的釋放。Hu等[24]在體外應用重組HBc蛋白和HBe蛋白干預，證實其可增強mTOR的活性，降低中性粒細胞的自噬作用及抑制ERK和p38 MAPK的依賴ROS的激活，減少NETs的釋放，以逃脫被捕獲和殺滅。滿姍姍[25]納入CHB患者和健康人各50例，發現CHB患者NETs的釋放能力顯著低于健康人，且HBsAg、HBeAg和抗-HBc的水平與NETs的釋放呈負相關，猜測HBV可能對NETs的釋放起抑制作用。HBeAg是一種分泌性非結構蛋白，HBV能夠抑制NLRP3炎癥小體的活化和IL-1β的成熟，主要是HBeAg抑制NF-κB信號通路和ROS的產生[26]，Leu等[27]應用重組HBeAg(rHBe)研究發現，rHBe抑制了單核細胞和中性粒細胞的遷移，在PMA刺激中性粒細胞后，rHBe降低了兩種細胞的呼吸爆發，減弱了中性粒細胞釋放NETs的能力。

肝硬化是一種慢性的、進行性的、破壞性的肝臟損害，同時伴有結締組織的修復活動和收縮的綜合征[28]。前期報道[29]指出，肝硬化患者的中性粒細胞在產生ROS方面存在缺陷，主要體現在超氧陰離子和過氧化氫的生成，這可能是導致肝硬化患者NETs釋放能力不足的原因。自發性細菌性腹膜炎(spontaneous bacterial peritonitis,SBP)是肝硬化患者的一個重要并發癥，主要是由于腹腔和腹水的突然感染引起。臨床研究[30]發現，與健康受試者相比，患有SBP的肝硬化患者外周血和腹水中的中性粒細胞釋放NETs的能力有所降低，主要是由于SBP患者的NADPH氧化酶功能缺失，最終影響ROS的產生，NETs釋放能力受損，這種損傷與肝硬化失代償程度成正比[31]。

3.3 肝癌 Seo等[32]臨床研究結果顯示，接觸系統的激活和NETs的形成與肝病的嚴重程度密切相關，與健康者相比，肝細胞癌(HCC)患者NETs形成的標志物(DNA-組蛋白復合物、雙鏈DNA、NE)和接觸系統的標志物(Ⅻa因子、高分子激肽原)的表達顯著升高，且門靜脈血栓形成的HCC患者明顯高于無門靜脈血栓形成的患者，提示NETs和接觸系統的標志物可作為HCC患者血栓形成的危險因素。體外研究[33]表明，NETs參與了手術應激后向肝轉移的發展，可觸發癌細胞釋放高遷移率族蛋白B1，激活TLR9信號通路，促進癌細胞黏附、增殖、遷移和侵襲，可作為降低腫瘤復發的因素。

von Meijenfeldt的團隊[34]發現，在整個肝移植過程中，與健康對照組相比，肝移植患者血漿中游離DNA、核小體和NETs標志物的水平較高，圍手術期時，高表達的游離DNA和核小體參與肝移植過程中復雜的止血平衡，說明游離DNA和NETs可能通過激活凝血作用促進肝移植過程中的止血再平衡。

4 小結

NETs是細胞外DNA的網狀結構，與抗菌分子有關，已被確定為脊椎動物先天免疫防御的一個重要組成部分[35]。我國是CHB的高發病率國家[36-37]，現代醫學認為，CHB與機體免疫功能低下有關，HBV感染后會經歷從免疫耐受期到免疫清除期，再到非活動期和可能的再活動期4個過程[38]，雖然已發現HBV能夠抑制NETs的釋放，但具體的作用過程及相關的信號轉導有待完善。另外，研究[39]指出，NETs可直接殺死癌細胞或刺激免疫系統而具有抗癌特性，又可能促進癌細胞的遷移和免疫逃逸，或構成癌細胞與免疫功能細胞之間的物理屏障而具有促癌作用，NETs在肝癌中作用分子機制報道較少，還需要深入探討。有證據表明中性粒細胞及其細胞內成分在自身免疫性肝病中發揮作用，但NETs作為一種激發機制參與自身免疫性肝病尚未得到詳細研究[8]。

隨著社會的進步，工作壓力、飲食結構及生活習慣等引起的酒精性或非酒精性肝病在我國的患病率迅速升高[40]，對其研究也日益成為焦點。研究指出，急性飲酒會促進中性粒細胞浸潤且加重慢性飲酒引起的肝損傷[41]，因此有必要關注NETs在酒精性或非酒精性肝病中的研究。NETs作為肝病領域中新的研究點，探討其作用機理，細化其作用靶點，勢必為肝病的治療干預提供新方向。