大鼠腎缺血-再灌注損傷后血清TNF-α、IL- 6及Bcl- 2、Fas表達變化的意義

【摘 要】目的 探討大鼠腎缺血再灌損傷后血清中TNF-α、IL- 6的變化以及Fas、Bcl- 2蛋白在腎小管上皮細胞中表達的變化，并分析在AKI發病機制中的作用。方法 用無損傷動脈夾鉗夾大鼠雙側腎蒂40min制成IR I動物模型。觀察缺血再灌注（IR）后2h、6h、12h、24h、48h血清中TNF-α、IL- 6的變化（ELISA法）及SCr的變化（苦味酸法）和以上各灌注時間點腎臟的病理變化（HE染色）以及IR后12h Fas、Bcl- 2蛋白的表達情況（免疫組化法）和與腎小管上皮細胞凋亡的關系（TUNEL法）。結果 腎小管上皮細胞凋亡在IR后12h明顯增加，以皮髓交界區明顯，陽性細胞率（%）為77.74±5.00%，而假手術組（Sham組）陽性率（%）為2.03±0.82%，兩組差異具有顯著性（P<0.01）；血清TNF-α、IL- 6在IR后12h含量明顯增高，分別為130.58±36.57、352.70±58.32（pg/ml），并與SCr的升高對應；Fas在IR后12h腎小管上皮細胞陽性率（%）為83.23±2.22%，Sham組陽性率（%）為3.02±0.82%（P<0.01）；Bcl- 2在IR 12h組及Sham組中腎小管上皮細胞陽性率（%）分別為0.40±0.05%、2.00±0.90%，差異具有顯著性（P<0.01）。結論 TNF-α、IL- 6參與了AKI的病理生理過程；TNF-α可能通過上調 Fas和下調Bcl- 2參與對腎小管上皮細胞的凋亡調控。

【關鍵詞】缺血-再灌注損傷；細胞凋亡；TNF-α；IL- 6；Bcl- 2；Fas

缺血-再灌注損傷是導致急性腎損傷（Acute Renal Injury，AKI）的常見原因之一。腎臟缺血再灌損傷早期的細胞死亡在AKI的發生機制有關鍵作用[1-2]。現代醫學已得出結論，Bcl-2、Bax、Fas等凋亡調節蛋白及許多炎癥因子如TNF-α、細胞因子及生長因子會在細胞凋亡過程中發揮重大影響[3-5]。凋亡腎小管上皮細胞在AKI中的病理生理作用及形態學改變尚不完全清楚。本實驗以缺血再灌損傷的動物模型從分子水平進一步探討急性腎損傷中腎小管上皮細胞Bcl-2、Fas蛋白表達及血清中TNF-α、IL-6的變化對細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 SD大鼠，雌雄不拘，體重100～120g，細胞凋亡檢測試劑盒，Fas免疫組化染色試劑盒、Bcl- 2免疫組化染色試劑盒，大鼠TNF-αELISA試劑盒， 大鼠IL- 6 ELISA試劑盒（美國BPB Biomedical）。

1.2 方法

1.2.1 腎缺血再灌注（IR）動物模型制備SD大鼠放在室溫為18～22℃的環境下按日常標準喂養。2%戊巴比妥鈉30～40mg/kg腹腔內注射，腹部正中線切口，用無損傷動脈夾鉗夾雙側腎蒂40min造成缺血-再灌注損傷動物模型，松開后觀察到大鼠腎臟由顏色變成鮮紅，即灌注成功。處理好傷口之后照常標準喂養。依次在模型建立之后2小時、6小時、12小時、24小時、48小時分批處死動物，心臟采血檢測TNF-α、IL-6、SCr。采集血樣后馬上將左側腎臟摘下來，用4%多聚甲醛固定后作常規石蠟包埋切片。假手術組（Sham組）僅暴露雙側腎臟，不鉗夾腎蒂，其余處理方式相同。

1.2.2 實驗分組48只健康、雄性SD大鼠，隨機分為6組（每組8例）：_ Sham組；_ IR2h組；_IR6h組；_IR12h組；_ IR24h組；_IR48h組；實驗方法同上。

1.2.3 腎小管上皮細胞凋亡的檢測取HE染色切片相鄰的切片常規脫蠟入水，并按試劑盒流程處理，用顯微鏡觀察。腎小管上皮細胞核中出現的棕黃色顆粒就是陽性細胞，即凋亡細胞。檢測結果分析：隨機選取5個200倍清晰視野，并采用圖像分析儀計數視野中的細胞總數及陽性細胞數，然后得出每張切片的陽性細胞百分率。

1.2.4 采用SABC免疫組化法檢測腎小管上皮細胞中Fas及Bcl-2表達水平腎小管上皮細胞膜或胞漿著色呈棕黃色者為Fas陽性細胞；腎小管上皮細胞漿著色呈棕黃色者為Bcl-2陽性細胞。檢測分析同上。

1.2.5 腎功能采用Beckman全自動生化分析儀檢測SCr，苦味酸法。

1.2.6 血清TNF-α、IL-6測定每個標準品和標本的OD值減去零孔的OD值；標準品濃度作為橫坐標，OD值作為縱坐標，用線連接個標點，通過標本的OD值就可查出其濃度。

1.3 統計學處理

應用SPSS 11.0統計軟件包處理數據，計量資料進行t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，P﹤0.05認為有統計學意義。

2 結果

2.1 形態學改變

2.1.1 HE染色

Sham組：一切正常；IR2h組：腎小管上皮細胞呈不規則形狀排列，腎小球一切正常，間質之間存在淤血現象；IR6h組：腎小管上皮細胞瓦解并脫落，管腔呈現蛋白管型，紅細胞管型，細胞碎片，腎小球腫脹變形，炎性細胞浸潤；IR12h組：腎小管上皮細胞瓦解較為顯著，可觀測到灶性壞死區和裸基底膜，結構模糊不清，蛋白管型大量出現，紅細胞管型及細胞管型，腎小球腫脹，腎小囊腔變得狹窄，并且可以觀察到白色滲出物質，炎性細胞浸潤；IR24h組：腎小管上皮細胞仍有脫落，細胞扁平，管腔擴張，不規則，腎小球的灌注較好，間質淤血減輕；IR48h組：腎小管上皮細胞腫脹，管型少見，細胞核大小不等，損傷較前減輕，腎小球基本正常，灌注較好，間質淤血減輕。

2.1.2 腎小管上皮細胞凋亡 Sham組凋亡細胞百分率明顯低于IR12h 組，陽性率分別為2.03±0.82%，77.74±5.00%（P﹤0.01）（見表1），以皮髓交界區為甚，見圖1

2.2 Fas及Bcl- 2免疫組化結果

2.2.1 Sham組Fas少量分布于腎小管上皮細胞，而IR12h組表達明顯增強，見圖2，其陽性細胞百分率分別為：3.02±0.82%，83.23±2.22%（P﹤0.01）見表1

2.2.2 Sham組Bcl-2少量分布于腎小管上皮細胞，以遠端小管為甚，而IR12h組腎小管上皮細胞表達更為減少，見圖3，其陽性細胞百分率分別為：2.00±0.90%，0.40±0.05%（P﹤0.01）見表1

2.3 腎功能

IR后2h SCr水平逐漸升高，以IR后12h最為明顯，IR后24h SCr水平逐漸恢復。Sham組及IR12h組SCr分別為：29.04±9.59（μmol/l），196.97±19.94（μmol/l）見表2（每組8例，χ±s）（P﹤0.01）

2.4 清TNF-α、IL-6含量血清TNF-α、IL-6變化趨勢與SCr一致，Sham組及IR12h組血清TNF-α含量分別為：19.54±3.00（pg/ ml），130.58±36.57（pg/ml），Sham組及IR12h組血清IL-6含量分別為：65.72±16.45（pg/ ml），352.70±58.32（pg/ml）見表2（每組8例，χ±s）（P﹤0.01）。

表1 腎缺血再灌注后12小時腎小管上皮細胞凋亡、Fas、Bcl-2蛋白表達的比較 [陽性細胞百分率（%）]

組別

例數（n）

凋亡細胞（%）

Fas（%）

Bcl-2（%）

Sham組

8

2.03±0. 82

3.02±0.82

2.00±0.90

IR12h組

8

77.74±5.00（1）

83.23±2.22（1）

0.40±0.05（1）

注：與Sham組比較，（1）P﹤0.01

表2 腎缺血再灌注后12小時血清中SCr（μmol/l）、TNF-α、IL-6（pg/ml）水平（χ±s）

組別

例數（n）

SCr（μmol/l）

TNF-α（pg/ml）

IL-6（pg/ml）

Sham組

8

29.04±9.59

19.54±3.00

65.72±16.45

IR12h組

8

196.97±19.94（1）

130.5±36.57（1）

352.70±58.32 （1）

注：與Sham組比較，（1）P﹤0.01

3 討論

隨著現代醫學飛速發展，IRI機制在AKI的發生中備受關注。此實驗表明，IR所致的AKI中存在腎小管上皮細胞凋亡的情況，尤其以皮髓交界區最為常見，此現象極有可能跟腎缺血再灌注后腎皮髓質的能量差異有密切關系；除此之外還可能由于缺血再灌注后細胞內鈣超載、氧自由基增多、炎性介質釋放等多種因共同作用下而導致，確切機制仍未完全清楚。本實驗表明，細胞凋亡是缺血再灌注所致AKI中腎小管上皮細胞死亡的重要方式，在腎功能損害最嚴重時細胞凋亡數目逐漸遞增，由此可見細胞凋亡在腎功能損害中起著相當重要的作用。HE染色提示缺血再灌注后12h腎小管上皮細胞結構不清、排列紊亂、脫落、灶性壞死、管型形成、炎性細胞浸潤等改變相對于其他各組織損害最為嚴重，由此可分析出在急性腎損傷的極期壞死與凋亡可共存于同一模型中，嚴重影響了腎功能。

急性腎損傷的得病人群很廣泛，任何一個年齡段的人都會發生，但是最容易得的急性腎損傷的應該是老年人。年紀大的人，可以理解，它的腎臟老化了，那么血管病變高血壓器官老化比較明顯，這樣腎臟耐受打擊的能力下降。所以他們容易得急性腎損傷；通過持續性腎臟替代治療清除血清TNF-α、IL-6能改善AKI患者預后。TNF-α是一種單核細胞來源的致死性因子。本實驗中血清TNF-α、IL-6在缺血再灌注后12h相對較高，比假手術組有高度顯著性（P﹤0.01），且與SCr變化程度相一致，此現象表明缺血性急性腎損傷也可能由于炎癥而引起。腎缺血再灌注可能會引起全身或者局部炎癥，釋放了包括TNF-α、IL-6在內的多種炎癥介質，這些炎癥因子的產生將啟動腎IRI的炎癥級聯反應。TNF-α和FasL可能通過炎性腎小球漏出到達腎小管上皮細胞或者局部分泌增加，來發揮其對腎小管的生物學作用。當前醫學界公認的是IL-6是AKI炎癥因子之一，可由內皮細胞在缺氧和TNF-α刺激下合成[8]。次試驗表明TNF-α可能是腎缺血再灌注的損傷因子，可能介導AKI極期的細胞凋亡。

此實驗研究顯示腎缺血再灌注后12h Fas蛋白顯著增高，并且以皮髓交界區明顯，假手術組Fas蛋白僅少量表達，表明Fas可能介導缺血性急性腎損傷極期腎小管上皮細胞凋亡過程， 認為Fas的上調與局部TNF-α增高有關，但TNF-α與Fas結合后信號傳遞的確切機制仍不清楚，需要進行進一步探討。

本實驗發現Bcl-2蛋白在假手術組中可呈少量陽性表達，而在缺血再灌注后12小時下調，缺血再灌注所致急性腎損傷極期，Bcl-2蛋白的下調與TNF-α大量釋放有關。TNF-α可通過抑制 Bcl-2及Bcl-xl的mRNA的表達，導致Bcl-2/Bax和Bcl-xl/Bax比值下降而發生細胞凋亡[9]；另一方面缺血性急性腎損傷中Bcl-2的下調也可能與某些生存因子的相對缺乏有關[10]。

綜上所述，此實驗結果表明腎缺血再灌注損傷動物模型中確實存在細胞凋亡現象。凋亡調控蛋白表達的改變極有可能是炎癥引起，TNF-α大量釋放后通過上調Fas和下調Bcl-2蛋白來參與。本研究提示，促進抗損傷機制而抑制腎臟損傷，延緩細胞凋亡，誘導再生，對組織損傷后解剖生理及功能的恢復將有重要意義。

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圖1 IR 12h腎小管上皮細胞凋亡情況（10×100）（如箭頭所示） 圖2 IR 12h腎小管上皮細胞Fas表達情況（10×100）（如箭頭所示）

圖3 腎小管上皮細胞Bcl- 2表達情況（10×100）（未見Bcl- 2陽性細胞）