用于高度降解mRNA樣本的非反轉錄基因表達量測定方法

摘 要 許多生物樣本（如石蠟包埋組織樣本）中的mRNA易斷裂為小片段利用傳統方法檢測較困難為了測定高度降解的mRNA本研究針對待測mRNA短片段設計一對探針當探針與待測模板雜交后通過連接反應將兩條探針′與3′端相連連接產物作為PCR擴增模板進行實時熒光定量檢測從而對待測mRNA進行定量測定以人AC基因為待測靶標通過測定不同濃度的待測靶標及與待測靶標序列不同的RNA片段分別考察方法的靈敏度與特異性并檢測肺癌石蠟切片樣本中AC基因的表達量與傳統的反轉錄定量PCR檢測結果進行了對比本方法的檢出限為10fmol/L定量線性范圍為10fmol/L～300pmol/L并且具有良好的特異性在對石蠟包埋組織樣本中的基因表達量檢測時本方法擴增檢測C值比反轉錄實時定量PCR小表明本方法更適合對高度降解的mRNA樣本進行定量測定

關鍵詞 連接反應；基因表達量；高度降解RNA；實時熒光定量PCR；石蠟包埋組織樣本

1 引 言

隨著核酸檢測技術的不斷進步基因表達量的分析已逐漸成為生物學與醫學研究的常規手段之一并已在未知基因功能研究、基因間相互作用研究及個體化用藥＼1＼相關研究領域發揮重要的作用

基因表達量檢測常見的方法有Northern印記法＼3＼、微陣列法＼＼、焦磷酸測序法＼6～9＼及實時定量PCR＼10＼（qPCR）法等其中qPCR法的檢出限約為10copies/mL線性范圍為10～1010copies/mL因其靈敏度高、特異性好、定量準確成為目前應用最為廣泛的基因表達量檢測方法然而利用傳統的基于反轉錄的定量PCR方法對一些特殊樣本的基因表達量測定比較困難如福爾馬林固定、石蠟包埋樣本（ormalinfixedandparaffinembeddedPE）這類樣本因其特殊的保存條件使樣本中mRNA發生交聯和斷裂＼11＼導致反轉錄后的cNA產物長度較短無法作為PCR擴增的模板使定量測定結果不準確有研究表明對于長年限PE樣本其定量結果只有新鮮樣本的10%即信號下降了90%之多＼1＼盡管已有一些針對短鏈的microRNA檢測的方法如Northernblotting技術＼13＼及莖環反轉錄qPCR技術＼1＼等但它們依然存在反轉錄效率不高、定量不準等缺點因此為了準確測定PE樣本中的基因表達量需要建立一種更適合于高度降解的mRNA的檢測方法

本研究基于連接反應建立了一種非反轉錄基因表達量檢測方法以待測mRNA為模板通過連接反應將兩條帶有通用擴增引物序列的核酸探針進行連接利用一對通用引物對連接產物進行實時熒光PCR擴增檢測從而實現對待測mRNA的定量測定本方法無需反轉錄操作簡便探針雜交區域短能夠測定短至0～30nt的目標mRNA分子適合于高度降解的mRNA樣本的測定

實驗部分

1 儀器與試劑

EC10型基因擴增儀東勝創新生物科技有限公司；tepOne實時熒光定量擴增儀（美國Appliediosystems公司）；低速離心機、渦旋振蕩儀（日本omy公司）；O1000型紫外分光光度計（南京五義科技有限公司）

PE樣本RNA提取試劑盒（miRNeasyPEit德國Qiagen公司）；RNA連接酶（RNALigase美國NE公司）；磷酸化激酶（Polynucleotideinase大連aaRa公司）；實時熒光定量反應混合液（YRPremixExaqTMPremixExaqTM大連aaRa公司）；反轉錄試劑盒（ranscriptirsttrandcNAynthesisuperMix北京全式金公司）；焦碳酸二乙酯（iethylpyrocarbonateEPC美國igma公司）；其它試劑均為分析純；實驗用水均為滅菌雙蒸水并做RNA酶滅活；實驗中所用的管子和槍頭均經過01%EPC水處理；肺癌PE樣本來自于解放軍第八一醫院和南京軍區南京總醫院

實驗中涉及到的寡聚核苷酸序列如表1所示