乳酸菌與大腸桿菌相互作用的研究

文 / 董雪鳳 楊子彪 任發政

（1云南大理來思爾乳業有限責任公司；2中國農業大學食品科學與營養工程學院）

大腸桿菌群是指一群能發酵乳糖、產酸產氣、需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌主要來源于人畜糞便，一般不致病，為人和動物腸道中的常居菌，但在一定條件下可引起腸道外感染。人在感染大腸桿菌后的癥狀為胃痛、嘔吐、腹瀉和發熱，感染可能是致命性的。該菌對熱的抵抗力較其它腸道桿菌強，在自然界的水中可存活數周至數月，是食品污染的主要來源[1]。

目前，我國奶牛主要以家庭小規模飼養為主，牛舍設施不良，擠奶和收奶過程不規范，加之牛奶營養豐富，很容易造成原料奶的污染，被普遍認為是致病性大腸桿菌的主要污染來源[2]。乳酸菌對大腸桿菌有一定的抑制作用[3]，可以用來提高乳制品的安全性。另外原料奶中污染大腸桿菌也會影響酸奶發酵劑的性能，從而影響發酵乳的質量。本文針對保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合菌種對大腸桿菌的抑制作用和大腸桿菌對乳酸菌的影響進行了研究，為乳酸菌在發酵乳中的應用提供了更多的科學依據。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 乳酸菌

保加利亞乳桿菌L5、嗜熱鏈球菌G7，由云南大理來思爾乳業提供。

1.1.2 大腸桿菌

從乳品中分離。

1.1.3 試劑

（0.1000±0.0002） mol/L氫氧化鈉標準溶液、0.5%酚酞指示劑、95%乙醇、濃硫酸、硫酸鉀、硫酸銅、30 g/mL硼酸溶液、甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑、0.0500 mol/L硫酸標準溶液、40%氫氧化鈉溶液、鄰苯二胺、濃鹽酸等，除特殊標注的試劑外，均為國產分析純試劑。

1.1.4 脫脂奶RSM（12%，W/V）

無抗生奶加無抗奶粉脫脂（奶粉添加量為脫脂后固形物含量的12%）， 115 ℃滅菌15min。

1.1.5 M17培養基

酪蛋白胨5 g、聚蛋白胨5 g、植物蛋白胨5 g、酵母浸膏2.5 g、牛肉膏5 g、磷酸甘油10 g、硫酸鎂0.25 g、維生素C 0.5 g、 蒸餾水950 g；pH值7.1～7.2；121 ℃滅菌15 min。

1.1.6 MRS培養基

pH值6.2～6.4，固體培養基加瓊脂粉，121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器和設備

SNB-1數字粘度計、KDY-9830凱氏定氮儀、pH211精密酸度計、DGF30121電熱鼓風干燥箱、LRH-250A生化培養箱、AL204電子天平凈化工作臺、QL-901混合器、XS-212-201顯微鏡。

1.3 乳酸菌對大腸桿菌的抑制作用

1.3.1 瓊脂平板

取樣品10 mL，無菌條件下1 500 rpm離心10 min，收集上清液。將已滅菌的濾紙片放入上清液中，浸泡10 min后，備用。取100 μL不同濃度大腸桿菌24 h乳糖膽鹽培養物，涂布于伊紅美藍瓊脂平板上。然后將帶有乳酸菌上清液的濾紙平整地置于含有不同濃度大腸桿菌的伊紅美藍瓊脂平板上，4 ℃擴散過夜，置于37 ℃培養24 h，測量抑菌圈直徑大小[4～5]。

1.3.2 RSM培養基

將不同活力的乳酸菌樣品與不同濃度的大腸桿菌同時接種于RSM培養基中，發酵不同時間，取出，分別作大腸桿菌最近似值數的檢測[6]。

1.3.3 乳酸菌的活力

取脫脂奶RSM培養基10 mL，將待測發酵劑按3%接種量接入脫脂乳中，37.8 ℃恒溫培養3.5 h。取出加入20 mL蒸餾水及2 mL 1%的酒精酚酞指示劑，用0.1 M氫氧化鈉溶液滴定至粉紅色，30 s不褪色，記錄消耗氫氧化鈉的體積數，按下式計算：乳酸菌的活力=0.1 M氫氧化鈉的體積數×0.009×10×1.0290%。

1.4 大腸桿菌對乳酸菌的影響

取保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌（1∶1）混合乳酸菌樣品100 mL，按3%的接種量接種于脫脂奶RSM中，并加入1%的大腸桿菌，42 ℃發酵。凝乳后置于4 ℃冰箱中，24 h后，取出按3%的接種量接種于脫脂奶RSM中，42 ℃發酵，凝乳后4 ℃貯存。如此反復，每反復1 次算1 代，取2、4、6 代乳酸菌和大腸桿菌混合培養物與原乳酸菌樣品進行對比。

將2、4、6 代乳酸菌樣品與原樣品分別作乳酸菌加工物性研究，具體指標和方法為：

1.4.1 產酸能力的測定

乳酸菌的產酸能力以單位時間pH值的變化（ΔpH）為評價指標。將原乳酸菌樣品與2、4、6 代乳酸菌和大腸桿菌混合培養物以3%的接種量接種到10 mL已滅菌的RSM中，于37 ℃條件下培養。分別使用pH計在0、1、2、3、4和5 h測定凝乳的pH值。

1.4.2 產香能力的測定[7]

將原乳酸菌樣品與2、4、6 代乳酸菌和大腸桿菌混合培養物以3%的接種量接種到100 mL已滅菌的RSM中，于37 ℃條件下培養3 h后取出，放置在4 ℃下保存，24 h后測定酸乳中的聯乙酰含量。

1.4.3 水解蛋白能力的測定

將原乳酸菌樣品與2、4、6 代乳酸菌和大腸桿菌混合培養物以3%的接種量接種到已滅菌的RSM中，于37 ℃條件下培養。當凝乳的pH值下降到4.6時取出，放置在4 ℃下保存。7 天后測定酸乳中的可溶性氮。

1.4.4 產粘能力的測定

將原乳酸菌樣品與2、4、6 代乳酸菌和大腸桿菌混合培養物以3%的接種量接種到已滅菌的RSM中，于37 ℃條件下培養。當凝乳的pH值下降到4.6時取出，立即用流水將其溫度降到（30±1）℃，使用粘度計測定凝乳的粘度值。

1.4.5 噬菌體檢測[8]

用雙層平板法，觀察有無噬菌斑的形成。

表1 乳酸菌抑菌作用結果

表2 不同發酵時間液體培養抑菌試驗結果 單位：CFU/mL

2 結果與討論

2.1 平板培養抑菌試驗

以不同濃度大腸桿菌作指示菌，用不同活力的混合乳酸菌進行平板培養的抑菌試驗，結果都有不同程度的抑菌效果，抑菌圈都在1.2～1.8 cm之間，效果更為顯著的是混合乳酸菌，活力為0.84%。大腸桿菌濃度在1∶100的平板抑菌，其抑菌圈均為1.8 cm。試驗結果見表1。

將不同活力混合乳酸菌試驗結果作比較，發現混合乳酸菌活力強，抑制作用強。同樣，將相同活力的乳酸菌作抑菌片，放入不同濃度的大腸桿菌平板平皿中，結果顯示大腸桿菌濃度低的抑制作用強。

2.2 液體培養抑菌試驗

取不同活力的混合乳酸菌樣品，按3%的接種量接種于RSM培養基中，分別加入1%、2%、3%的大腸桿菌，在42 ℃條件下發酵3、6、9、12、15、18、21、24、27 h。依照國標GB 4789.3—94大腸菌群的檢驗方法，檢測液體培養基RSM中大腸菌群的最近似值。試驗結果見表2。

從表2中可以看出，不同活力的乳酸菌中加入一定數量的大腸桿菌后，隨著發酵時間的延長，大腸桿菌數量逐漸減少，最終被抑制；相同活力的乳酸菌中加入不同質量分數的大腸桿菌，發酵相同的時間，大腸桿菌濃度低的，檢測出的大腸桿菌數量也少，大腸桿菌濃度高的，檢測出的大腸桿菌數量多；不同活力的乳酸菌，發酵時間相同，活力高的檢測出的大腸桿菌數量少，活力低的乳酸菌檢測出的大腸桿菌數量相對多[9]。

表3 不同代數產酸能力表（以pH值表示）

表4 菌株的生長及加工特性

2.3 大腸桿菌對乳酸菌的影響

取乳酸菌樣品和2、4、6 代乳酸菌和大腸桿菌混合培養物，分別作菌種產酸率、生長能力、產粘能力、水解蛋白能力、產香能力的研究。原乳酸菌和2、4、6 代乳酸菌和大腸桿菌混合培養物產酸能力見表3。

從表3中可以看出，相同的起始酸度，同樣的接種量，發酵相同的時間，隨著大腸桿菌在乳酸菌中時間的延長，乳酸菌的產酸能力逐漸減弱。

在酸奶生產中，菌種的篩選具有非常重要的意義，扮演著至關重要的角色。菌種的選擇直接關系到酸奶的質量、粘度、風味以及酸奶的多種功能特性。選擇產酸力適中，產香性能高，有適當蛋白水解性的菌株，有利于形成具有良好功能特性的產品。產酸力適中，便于酸奶的凝固，抑制后酸的上升，延長酸奶的貨架期。產香性能高，可使形成的酸奶具有濃郁的香味，有利于終產品良好風味的形成。酸奶中的羰基化合物，主要是聯乙酰、乙醛等，它們以一定的比例存在，是構成酸奶風味的基礎物質。Bottazzi（1983）的研究表明，聯乙酰在酸乳中含量在5 mmol/L以下可產生良好的風味。發酵劑分解酪蛋白產生肽和氨基酸，對酸奶的成熟及風味的產生有著重要的作用。因此產酸能力、產粘能力、產香能力、水解蛋白能力、生長能力為酸奶發酵劑菌種的重要指標。

從表4中可以看出，原乳酸菌經大腸桿菌污染后，產香能力從（4.441±0.012）mg/L降到（3.854±0.011）mg/L，產粘能力從（2.89±0.01）pa.s降到（2.89±0.01）pa.s，酸奶硬度也逐漸降低，而水解蛋白能力幾乎不受影響。用雙層平板試驗，結果2～4 代樣品不受噬菌體的感染。

3 結論

乳酸菌對大腸桿菌有明顯的抑制作用，其抑制作用強弱受乳酸菌活力和大腸桿菌濃度影響。乳酸菌活力強，其對大腸桿菌的抑制作用強；大腸桿菌濃度低，乳酸菌對它的抑制作用也高。

大腸桿菌對乳酸菌也有一定的影響，隨著大腸桿菌污染乳酸菌時間的延長，乳酸菌的產酸能力、產香能力、產粘能力、硬度都逐漸減弱。

[1]顧瑞霞主編.乳與乳制品的生理功能特性.北京：中國輕工業出版社，2000.

[2]羅祎，趙晉府，周爾明.微生物檢測國標法和濾膜法的比較.食品工業技術，1999，10（6）：54-56.

[3]楊潔彬，凌代文，郭興華，等.乳酸菌——生物學基礎及應用.北京：中國輕工業出版社，1996.

[4]楊家軍，黃克和，秦順義，等.四株益生菌體外抑制大腸桿菌K88株的研究.江蘇農業學報，2008，24（3）：302-306.

[5]丁柯，倪學勤，潘康成，等.三株乳酸桿菌體外抑菌試驗的研究.飼料工業，2004，24（3）：19-21.

[6]中華人民共和國國家標準.食品衛生微生物學檢驗.大腸菌群測定.

[7]王丹，劉鵬.酸奶中聯乙酰含量測定方法的初步探討.中國乳品工業，1992，20（2）：60-63.

[8]萬萍，朱維軍，貢汗坤.食品微生物基礎與實驗技術.北京：科學出版社，2005.

[9]張有安，竇春香.嗜酸乳桿菌制劑對致病性大腸桿菌抑制及控制仔豬腹瀉試驗.中獸醫學雜志.2009，149（4）：54-55.