浙江地區漢族人群IL-27p28基因多態性與克羅恩病的相關性研究

王立英 陳春曉 朱新建 項利娟

浙江地區漢族人群IL-27p28基因多態性與克羅恩病的相關性研究

王立英 陳春曉 朱新建 項利娟

目的 探討IL-27p28基因啟動子區g.-964 T＞C、第2外顯子區g.2905T＞G和第4外顯子區g.4730T＞C 3個位點的多態性與浙江地區人群克羅恩病（CD）的相關性。方法 選取75例浙江地區漢族CD患者（病例組）及80例健康體檢者（對照組），采用聚合酶鏈反應-連接酶檢測，分析兩組基因型頻率及等位基因頻率。 結果 對照組的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。兩組g.-964位點的基因型頻率及等位基因頻率的差異有統計學意義（P＜0.05），而g.2905和g.4730位點的基因頻率及等位基因頻率的差異無統計學意義（P＞0.05）。 結論 IL-27p28基因多態位點g.-964 T＞C可能與浙江地區漢族人群CD易感性有關，g.2905T＞G和g.4730T＞C多態性與浙江地區漢族人群CD無關。

IL-27p28 基因多態性 克羅恩病

克羅恩病（CD）是一種慢性非特異性胃腸道炎癥性疾病，其病因和發病機制尚未完全闡明，目前認為是由環境、遺傳、感染、免疫等多種因素相互作用所致。近年來研究發現，腸道黏膜免疫異常在炎癥性腸病（IBD）發生、發展過程中起重要作用[1]，其中細胞因子調節在介導這一免疫反應異常中扮演重要角色。IL-27是新近發現的IL-12家族成員之一，與IL-12具有相似的結構和生物學功能，參與多種免疫性疾病、感染性疾病、腫瘤等疾病的免疫調節過程[2]。目前已知，IL-27p28基因的3個多態性位點分別為：啟動子區g.-964 T＞C、第2外顯子區g.2905T＞G和第4外顯子區g.4730T＞C。2009年，Li等[3]韓國學者發現，位于IL-27p28基因多態性可能與韓國人群CD易感性相關。筆者在這一發現的基礎上通過分析該位點多態性，探討其與浙江地區漢族人群CD發病的相關性，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2007-01—2011-12在浙江大學醫學院附屬第一醫院（40例）和上虞市人民醫院消化內科（35例）就診或住院且臨床資料完整、彼此無血緣關系的75例漢族CD患者，其中男41例，女34例，年齡8～67歲，平均（37.43±12.45）歲；平均病程（5.37±4.29）年；CD活動指數183.47±53.61。選擇同期健康體檢者80例作為對照組，其中男45例，女35例，年齡18～60歲，平均（36.21±11.54）歲。CD的診斷標準參照中華醫學會消化病學分會炎癥性腸病協作組制定的《中國炎癥性腸病診斷治療規范的共識意見》[4]。排除標準：（1）非漢族人口；（2）合并其他自身免疫性疾病；（3）嚴重心、肺、肝、腎功能損害和神經、精神疾病；（4）糖尿病以及其他內分泌系統疾病；（5）近期有明確感染病史：近1個月曾使用糖皮質激素；近3個月曾使用免疫抑制劑；（6）服用避孕藥的育齡女性、孕期和哺乳期婦女；（7）創傷患者。本研究經浙江大學醫學院附屬第一醫院和上虞市人民醫院醫學倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。兩組性別、年齡的差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 采集EDTA抗凝靜脈血2ml，使用臨床樣品基因組DNA小量抽提試劑盒（上海生工生物工程技術服務有限公司）提取白細胞基因組DNA，溶解于TE緩沖液，定量后-20℃保存。

1.2.2 聚合酶鏈反應-連接酶檢測（PCR-LDR） IL-27g.-964T＞C、g.2905T＞G和g.4730T＞C位點多態性采用PCR-LDR技術分析。PCR擴增反應體系為基因組DNA 1μl、上下游引物各0.25μl（10μmol/L）、Taq酶0.2μl、10×PCR緩沖液2μl和 dNTPs 0.3μl（2.5mmol/ L），加去離子水至15μl，先94℃預變性2min，再94℃變性20s，62℃退火20s，72℃延伸40s，共進行40個循環，最后72℃3min。以上PCR產物2μl，10×Taq DNA連接酶緩沖液1μl，Taq DNA連接酶（40U/μl）0.125μl，每條探針（10bp）0.01μl，加去離子水至10μl。先94℃30s，再60℃3min，共進行20個循環。取1μl連接產物，加2μl上樣Loading Dye 95變性3min，立即冰水浴，測序儀（美國應用生物系統公司ABI 377型）檢測。實驗過程和基因型分析在上海捷瑞生物工程有限公司實驗室實施。上下游引物、探針和產物大小見表1。

表1 引物、探針序列及產物長度

1.2.3 測序 為驗證檢測方法的準確性，每1個位點均從所有樣本中按隨機數表法抽取5%的樣本進行測序（委托生物芯片上海國家工程研究中心實驗室實施）。

1.3 統計學處理 采用SHEsis軟件進行Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗，確定對照組是否可以代表浙江地區漢族群體。采用SPSS16.0統計軟件，計數資料組間比較采用χ2檢驗，并采用logistic回歸計算各位點的OR評估相對危險度，計算95%CI。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg平衡吻合度 對照組在g.-964 T＞C，g.2905T＞G和g.4730T＞C 3個多態位點的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡，表明所收集的樣本可以代表群體。

2.2 兩組基因型頻率、等位基因頻率分析 IL-27p28基因檢測結果顯示，g.-964位點出現TT純合、TC雜合和CC純合，g.2905位點出現TT純合和TG雜合，g. 4730位點出現TT純合、TC雜合和CC純合，兩組g.-964位點的基因頻率及等位基因頻率的差異有統計學意義（P＜0.05），提示該位點的多態性可能與浙江地區漢族人群CD易感性有關；而g.2905和g.4730位點的基因頻率及等位基因頻率的差異無統計學意義（P＞0.05），提示該位點的多態性與浙江地區漢族人群CD易感性無關，詳見表2。

3 討論

目前認為，腸道黏膜免疫應答異常在炎癥性腸病發病及病情加重過程中起重要作用，其中Th1/Th2細胞亞群之間的平衡失調是腸道黏膜免疫應答異常的關鍵因素。IL-27是新近發現的一種異源二聚體細胞因子,由特異的亞單位IL-27p28和EBI3組成[5]，與其受體結合后，通過激活JAK/STATs通路途徑轉導信號，引起特異的生物學反應[6]。IL-27在免疫反應過程中具有促炎和抗炎癥反應的雙重免疫調節作用。在T細胞增殖分化早期，IL-27通過STAT1、STAT3途徑促進初始CD4+T細胞分化為Th1細胞，同時可協同IL-12促進初始CD4+T細胞分化為Th1細胞，及促進初始T細胞、NK細胞產生IFN-γ[7]；IL-27還可通過上調初始CD4+T細胞ICAM-1的表達，介導ICAM-1/LFA-1信號途徑來促進Th1細胞分化[8]。Villarino等[9]在IL-27R-/-小鼠模型的研究證實了IL-27R缺乏可以降低結腸炎的發病率。這些研究充分證明了IL-27在CD的炎癥進展過程中發揮重要的免疫調節作用，IL-27可能是CD易感性研究的一個重要的候選基因。

表2 兩組基因型頻率、等位基因頻率分析[例（%）]

本研究中IL-27位點基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，說明選擇樣本具有群體代表性。本研究結果顯示，兩組IL-27啟動子區g.-964 T＞C的基因型頻率及等位基因頻率分布的差異有統計學意義，提示該位點的多態性可能與浙江地區漢族人群CD易感性相關,這與Li等[3]的韓國IBD人群易感性研究結果相同。同時，雖然本研究中g.2905T＞G和g.4730T＞C 2個位點的基因多態性與浙江地區漢族人群CD易感性未發現有相關性，其原因可能有種族差異、樣本數量不足等不確定因素，不排除這2個位點與其他人群CD具有相關性，也不排除IL-27基因其他位點與CD的發生具有相關性。

由于本研究病例數及地域較局限，故仍需行多中心大樣本的隊列研究，才能最終明確該基因多態性與中國漢族IBD發病的相關性，為進一步篩選中國人IBD的易感基因以及未來發展基因診斷和治療提供依據。

[1]Sartor R B.Mechanisms of disease:pathogenesis of Crohn's disease and ulcerative colitis[J].Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol,2006,3(7):390-407.

[2]Shimizu M,Shimamura M,Owaki T,et al.Antiangiogenic and antitumor activities of IL-27[J].J Immunol,2006,176(12):7317-7324.

[3]Li C S,Zhang Q,Lee K J,et al.Interleukin-27 polymorphisms are associated with inflammatory bowel diseases in a Korean population[J].J Gastroenterol Hepatol,2009,24(10):1692-1696.

[4]中華醫學會消化病學分會炎癥性腸病協作組.中國炎癥性腸病診斷治療規范的共識意見[J].中華內科雜志,2008,47(1):73-79.

[5]Pflanz S,Timans J C,Cheng J,et al.IL-27,a heterodimeric cytokine composed of EBI3 and p28 protein,induces proliferation of native CD4(+)T cell[J]．Immunity,2002,16(6):779-790．

[6]Yoshida H．Immune regulation by IL-27 for therapeutic usage [J].Nihon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi,2009,32(4):202-213．

[7]Takeda A,Hamano S,Yamanaka A,et al.Cutting edge:role of IL-27/WSX-1 signaling for induction of T-bet through activation of STAT1 during initial Th1 commitment[J].J Immunol,2003,170 (10):4886-4890．

[8]Owaki T,Asakawa M,Fukai F,et al.IL-27 induces Th1 differentiation viap38MAPK/T-bet-and intercellular adhesion molecule-1/LFA-1/ERK1/2-dependent pathways[J].J Immunol,2006,177 (11):7579-7587．

[9]Villarino A V,Artis D,Bezbradica J S,et al.IL-27R deficiency delays the onset of colitis and protects from helminth-induced pathology in a model of chronic IBD[J].Int Immunol,2008,20(6):739-752．

Association of IL-27p28 gene polymorphisms with Crohn's disease in Han population of Zhejiang province

Objective To investigate the association of IL-27p28 gene polymorphisms with Crohn's disease in Han population of Zhejiang province．Methods 75 patients with Crohn's disease and 80 healthy subjects from Han population of Zhejiang province were enrolled in the study.The g.-964 T＞C,g.2905T＞G and g.4730T＞C polymorphisms of IL-27p28 gene were analyzed by polymerase chain reaction-ligase detection reaction(PCR-LDR). Results The distributions of genotypes in both groups were fitted to Hardy-Weinberg equilibrium(P＞0.05)．There were significant differences in genotype and allele frequencies at g.－964T＞C site between patients and controls(P＜0.05),while those at g.2905 and g.4730 sites showed no significant differences between two groups(P＞0.05).Conclusion The polymorphism of IL-27p28 gene at-964T＞C site might be associated with the susceptibility to Crohn's disease in Han population of Zhejiang province,such association is not observed in sites 2905T＞G or 4730T＞C.

IL-27p28 Polymorphism Crohn's disease

2012-12-03）

（本文編輯：嚴瑋雯）

310003 杭州，浙江大學醫學院附屬第一醫院消化內科（王立英、陳春曉，王立英現在在上虞市人民醫院工作）；上虞市人民醫院消化內科（朱新建、項利娟）

陳春曉，E-mail:CHCHXOK@126.com