HIF-1α及VEGF在類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞中的表達及意義

彭勇 陳勇 鄔秀娣 羅晶 張振 黃嫻倩 干敏芝

HIF-1α及VEGF在類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞中的表達及意義

彭勇 陳勇 鄔秀娣 羅晶 張振 黃嫻倩 干敏芝

目的 研究類風濕性關節炎（RA）患者滑膜細胞在體外常氧和缺氧培養條件下缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）和血管內皮生長因子（VEGF）表達的差異性及意義。 方法 對RA患者及骨關節炎（OA）患者的關節滑膜細胞在體外常氧和缺氧條件下分別進行培養，根據培養條件分為常氧組、缺氧6h組及缺氧12h組；采用免疫印跡法分別檢測各組成纖維樣滑膜細胞的HIF-1α及VEGF的表達情況。結果 與常氧組相比，缺氧6h及12h的RA和OA患者滑膜細胞的HIF-1α及VEGF的表達均顯著增加，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。同時RA和OA患者缺氧12h組滑膜細胞HIF-1α及VEGF的表達高于缺氧6h組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。RA和OA患者3組滑膜細胞的HIF-1α及VEGF的表達均呈正相關（均P＜0.05）。常氧組RA與OA患者滑膜細胞的HIF-1α及VEGF的表達均無統計學差異（均P＞0.05）；而缺氧6h和12h組中RA滑膜細胞HIF-1α及VEGF的表達均高于OA滑膜細胞，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。 結論 在缺氧條件下RA患者滑膜細胞HIF-1α及VEGF表達顯著升高且密切相關，可能缺氧—HIF-1α—VEGF這一信號途徑在RA的發生、發展中起著重要作用。

類風濕性關節炎 骨關節炎 滑膜細胞 缺氧誘導因子-1α 血管內皮生長因子

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種 慢性系統性的以侵蝕性關節炎癥為主要表現的自身免疫病，其基本病理表現為滑膜炎和血管翳的形成。而骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種最為常見的慢性關節退行性疾病，其特征在于關節軟骨的變性、破壞以及軟骨下骨的改變。目前的研究已經證實RA受累關節微環境中存在缺氧[1]；并發現缺氧在RA血管新生中起著關鍵調節作用，包括誘導炎癥細胞的浸潤及炎癥因子[如血管內皮生長因子（VEGF）]的產生[2]。體內細胞缺氧反應的核心調節因子是缺氧誘導因子（HIF-1α）。缺氧時，HIF-1α可以激活40多種低氧適應性基因的表達，在RA成纖維細胞中參與能量代謝、細胞內信號轉導、血管生成、免疫及炎癥反應等的調節基因的表達均被上調[3]。VEGF是一種較強的刺激血管新生的物質，在血管新生中起著核心的作用。近年來有學者提出關節滑膜的炎癥在OA的發病過程中也起著十分重要的作用，尤其在發病的早期[4]；新生血管的形成也參與了OA關節軟骨的破壞[5]。因此，HIF-1α和VEGF可能在RA和OA的發病過程中均起著重要的作用。筆者采用蛋白免疫印跡法（Western blot）體外檢測RA和OA患者成纖維樣滑膜細胞在常氧和缺氧培養條件下HIF-1α和VEGF蛋白表達水平，分析兩者表達的差異性及相關性，探討其在RA發病機制中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 無菌獲取寧波市第二醫院及寧波市第六醫院關節外科行關節置換術的RA和OA患者各9例的滑膜組織。RA患者中男2例，女7例，年齡42～64歲，平均（54.3±10.5）歲；均符合2010年美國風濕病學會/歐洲風濕病聯盟（ACR/EULAR）的類風濕新關節炎分類標準[6]。OA患者中男4例，女5例，年齡54～75歲，平均（60.6±8.7）歲；均符合1995年ACR的OA診斷標準[7]。標本獲取前經兩家醫院醫學倫理委員會批準，且均獲得患者同意并簽訂知情同意書。標本獲取后置于盛有20ml無血清的DMEM培養基的50ml離心管中，2h內運送至實驗室進行處理。

1.2 主要試劑和儀器 眼科剪；眼科鑷；細胞培養皿及培養瓶（美國NUNC公司）；DMEM培養基及胎牛血清（FBS）（美國Hyclone/Thermo Scientific公司）；Tris-HCl緩沖液（TBS）及含0.2%吐溫的TBS緩沖液（上海索萊寶公司）；總蛋白提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（上海捷瑞生物工程有限公司）；PVDF膜（美國Millipore公司）；兔抗人HIF-1α多克隆抗體（一抗）（美國Cell Signaling公司）；兔抗人VEGF多克隆抗體（一抗）（美國Canta Cruz公司）；兔抗人β-actin單抗（一抗）及鼠抗兔二抗（北京博奧森生物技術有限公司）；Western Bright Quantum增強型發光底物（APG BIO環亞生物科技有限公司）；Bio-Rad蛋白凝膠電泳儀（美國Bio-Rad公司）；Thermo Scientific轉膜系統（美國Thermo公司）；Tanon-4200SF全自動數碼凝膠圖像分析系統（中國上海天能儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 滑膜細胞培養 將無菌的滑膜組織于生物安全柜中，在100mm細胞培養皿中用眼科剪和鑷子去除組織塊表面血污及脂肪組織，PBS緩沖液清洗2遍。將組織塊轉移至新的盛有DMEM培養基（含抗生素）的培養皿內，用新的眼科剪和鑷子將組織塊剪成1mm3的小塊；用槍頭或者眼科彎鑷，將組織塊擺放至新的25cm2的培養瓶內，間隔1cm左右，將培養瓶倒置（組織塊面朝上）于細胞培養箱中。孵育4h后向瓶內加入含15% FBS和青、鏈霉素雙抗的DMEM培養基5ml，然后將培養瓶輕輕翻轉讓培養基浸沒組織塊，置于培養箱內常規培養24h后換液，以后每隔2～3d換液。培養期間偶有組織塊離壁、漂浮，即時換液去除漂浮組織塊。待細胞匯集占瓶底面積90%時采用0.25%胰酶常規消化傳代，實驗所用滑膜細胞均采用第3～5代滑膜細胞。

1.3.2 實驗分組 將生長至90%左右的RA和OA第3～5代滑膜細胞均分為常氧組、缺氧6h組和缺氧12h組，分別將細胞置于常氧條件下（21%O2+5%CO2）和缺氧條件下（1%O2+5%CO2）培養6、12h。

1.3.3 Western blot檢測 分別收集各實驗組細胞，嚴格按試劑盒操作說明提取總蛋白，采用BCA法測定總蛋白濃度。取30μg總蛋白，加入適量的上樣緩沖液混勻，沸水浴中煮沸5min備用。制備SDS-PAGE凝膠，蛋白上樣。蛋白電泳：分離膠恒壓80V 20min，濃縮膠恒壓100V 90min；轉膜：轉膜前將濾紙于轉移緩沖液中平衡20min，恒流41mA半干轉2h，將蛋白轉到PVDF膜上。將膜置于5%BSA封閉液中封閉1h；采用TBST洗膜2次，每次10min，TBS洗膜1次，10min；加待測的相應目的蛋白的一抗（抗HIF-1α或抗VEGF抗體），4℃過夜孵育，同上洗膜；加二抗，室溫孵育1h，同上洗膜。ECL發光劑發光，Tanon-4200 SF全自動數碼凝膠成像儀中，CCD曝光成像。凝膠圖像分析軟件對結果進行吸光度掃描，以β-actin做內參進行校正，以HIF-1α和VEGF蛋白條帶的吸光度值比上各自β-actin的吸光度值為目的蛋白的相對表達量。

1.4 統計學處理 采用SPSS18.0統計軟件。計量資料用表示，3組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法；兩組間的比較采用t檢驗。兩種蛋白表達水平相關性分析采用Pearson相關分析。

2 結果

2.1 滑膜細胞生長情況 組織塊生長至第4天可見組織塊周圍有成纖維樣細胞爬出，培養第10天可見大量細胞圍繞組織快生長；培養至第16天可傳至第1代，見圖1、2。

圖1 RA原代滑膜細胞生長第4天

圖2 RA原代滑膜細胞生長第10天

2.2 RA和OA患者滑膜細胞中HIF-1α和VEGF蛋白表達情況 RA和OA患者滑膜細胞的HIF-1α和VEGF蛋白的Western blot結果見圖3、4。與常氧組相比，RA和OA缺氧6h組及缺氧12h組的滑膜細胞HIF-1α和VEGF蛋白表達均明顯增高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；而常氧條件下兩者的滑膜細胞HIF-1α和VEGF蛋白幾乎不表達。與缺氧6h組相比，缺氧12h組RA及OA滑膜細胞的HIF-1α和VEGF蛋白表達也均顯著增高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。此外，常氧組RA和OA兩者的HIF-1α和VEGF蛋白表達的差異均無統計學意義（均P＞0.05）；而缺氧6h組和缺氧12h組中RA滑膜細胞的HIF-1α和VEGF蛋白表達要高于同組的OA滑膜細胞的表達，差異均有統計學意義（均P＜0.05），詳見表1。

圖3 RA患者電泳凝膠圖

圖4 OA患者電泳凝膠圖

表1 RA和OA患者滑膜細胞常氧和缺氧條件下的HIF-1和VEGF表達情況

2.3 RA和OA滑膜細胞中HIF-1α和VEGF蛋白表達的相關性 分別將RA和OA患者3組滑膜細胞的HIF-1α和VEGF蛋白Western Blot結果進行相關分析，發現RA患者3組滑膜細胞的HIF-1α和VEGF蛋白表達呈正相關（r=0.971，P＜0.05）；OA患者滑膜細胞的VEGF表達與HIF-1α的表達也呈正相關（r=0.759，P＜0.05）。

3 討論

關節滑膜炎是RA關節炎的基本病理改變，關節滑膜的增厚、大量炎癥細胞的浸潤及炎癥因子的釋放造成了關節微環境的缺氧，從而導致了新生血管及血管翳形成。血管翳具有類似腫瘤組織侵蝕的特性，最終將導致關節軟骨和骨的破壞。血管翳的形成在RA的發生和發展中起著關鍵作用，而體內細胞缺氧反應的核心調節因子是HIF-1α。Brouwer等[8]應用重復染色方法對RA及OA的患者滑膜組織進行對照研究，發現RA患者滑膜組織襯里下層高表達HIF-1α，相反地OA滑膜組織細胞HIF-1α表達較低；同時還發現RA滑膜組織HIF-1α陽性細胞數與其血管數目、炎癥細胞浸潤數呈正相關。有研究也表明，早期活動組RA患者的血清HIF-1α要顯著高于OA患者組及健康對照組，并且高于中晚期活動組及穩定組RA患者[9]。同時有學者還發現RA患者血清中VEGF表達顯著增高且與患者受累關節滑膜呈正相關[10]。OA是以關節軟骨的變性、破壞以及骨質增生為特征的慢性關節病。類似的大量研究也發現OA患者受累關節中氧濃度顯著降低[11]。同時有學者對OA患者、急性創傷性關節炎及正常人滑膜組織共60例，進行HIF-1α、VEGF免疫組化染色，發現OA患者組的HIF-1α及VEGF表達要顯著高于其他兩組，且兩者的表達呈正相關[12]。

本研究通過對RA和OA患者滑膜細胞進行體外細胞原代培養，采用Western blot檢測其不同條件下HIF-1α及VEGF蛋白表達情況，發現RA和OA患者缺氧6h組及缺氧12h組滑膜細胞的HIF-1α及VEGF蛋白表達顯著高于常氧組，而常氧組的HIF-1α及VEGF幾乎不表達；與缺氧6h組相比，兩者滑膜細胞的HIF-1α及VEGF蛋白也隨之增加。同時對HIF-1α及VEGF的表達進行相關分析發現，RA和OA患者3組滑膜細胞的HIF-1α及VEGF蛋白表達呈正相關，以上結果均表明關節微環境的缺氧可以誘導滑膜細胞HIF-1α的高表達，進而促進VEGF的表達而產生作用。筆者推測，缺氧的持續存在促使了HIF-1α和VEGF蛋白的表達進一步升高，從而可能加劇了滑膜的炎癥。國內有學者對多例RA和OA患者受累膝關節進行關節鏡檢查及滑膜組織染色分析，鏡下發現RA患者滑膜組織增生及血管密度較OA患者明顯；染色發現RA滑膜組織表達的VEGF要顯著高于OA患者，同時分析發現滑膜組織增生程度與VEGF水平呈正相關[13]。而本研究從細胞水平對RA和OA患者3組滑膜細胞的HIF-1α及VEGF表達進行比較，發現RA缺氧6h組和缺氧12h組的滑膜細胞中HIF-1α及VEGF表達均高于同組OA滑膜細胞的表達，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；而兩者常氧組的表達則無統計學差異（P＞0.05）。通過文獻復習發現CaMKII（Ca2+/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶家族之一）表達于RA的成纖維樣滑膜細胞，而CaMKII可以調節HIF-1α等因子的轉錄激活；同時發現CaMKII的抑制劑可以抑制RA滑膜細胞HIF-1α及VEG的表達，這可能是通過抑制pI3K/Akt信號來實現的[14]。pI3K/ Akt和MAPK這兩條信號途徑是介導缺氧條件下RA滑膜細胞HIF-1α轉入激活的主要磷酸化途徑[15]。類似的研究發現青蒿琥酯可以通過抑制pI3K/Akt信號途徑進而降低RA成纖維樣滑膜細胞HIF-1α及VEG的表達[16]。同時有學者使用pI3K/Akt信號途徑抑制劑下調CIA大鼠模型的HIF-1α表達水平，發現其關節炎的臨床表現、影像學改變、滑膜的增生程度及炎癥細胞的浸潤都得到顯著改善[17]。因此，在缺氧條件RA成纖維樣滑膜細胞表達相關受體可以通過多種信號途徑從而能更有效的誘導HIF-1α的轉錄激活[18]，從而增加缺氧條件下RA滑膜細胞HIF-1α及VEGF的表達。這可能解釋RA滑膜細胞在缺氧條件下HIF-1α及VEGF表達顯著高于OA滑膜細胞。

綜上所述，體外缺氧條件培養的RA患者成纖維樣滑膜細胞HIF-1α及VEGF的表達水平要高于OA患者，且兩者的表達呈正相關。因此，筆者推測缺氧誘導的HIF-1α高表達及隨后產生的VEGF在RA的發病過程中起著十分重要的作用；而缺氧—HIF-1α—VEGF這一信號通路可能與RA的發生、發展有著十分密切的關系，通過改善缺氧、阻斷這一信號通路、拮抗HIF-1α及VEGF表達可能成為RA治療的新思路。

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Expression of HIF-1α and VEGF on fibroblast-like synoviocytes cells in patients with rheumatoid arthritis

Objective To investigate the expression of hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α)and vascular endothelial growth factor(VEGF)on fibroblast-like synoviocytes cells in rheumatoid arthritis and its correlation with normoxia and hypoxia. Methods Primarily cultured fibroblast-like synoviocytes cells from patients with rheumatoid arthritis(RA)and osteoarthritis(OA) were exposed to normoxia for 6h or hypoxia for 6h and 12h.The expression of HIF-1α and VEGF were detected by Western blot. Results The expressions of HIF-1α and VEGF in fibroblast-like synoviocytes cells from RA or OA patients exposed to hypoxia for 6h and 12h were higher than those exposed to normoxia(P＜0.05).Compared to those exposed to hypoxia for 6h,the expression of HIF-1α and VEGF in cells exposed to hypoxia for 12h was higher(P＜0.05).The expression of HIF-1α was positively correlated with VEGF in three groups(P＜0.05).The expressions of HIF-1α and VEGF in fibroblast-like synoviocytes cells from RA patients exposed to hypoxia for 6h and 12h were higher than those from OA patients correspondingly(P＜0.05),however, there were no significant difference in normoxic group between RA and OA patients(P＞0.05).Conclusion In hypoxia conditions the expressions of HIF-1α and VEGF on fibroblast-like synoviocytes cells from RA patients are significantly higher than those from OA patients,indicating that Hypoxia—HIF-1α—VEGF signaling pathway may be closely related to the occurrence and development of RA.

Rheumatoid arthritis Osteoarthritis Synoviocytes Hypoxia-inducible factor-1α Vascular endothelial growth factor

2013-07-16）

（本文編輯：嚴瑋雯）

（本文由浙江省醫學會風濕病學分會推薦）

寧波市社會發展科研項目基金資助（2012C50010）；寧波市自然基金項目資助（2013A610259）

315010 寧波市第二醫院風濕免疫科(彭勇、陳勇、鄔秀娣、張振、黃嫻倩、干敏芝)；寧波市第六醫院風濕免疫科（羅晶）

陳勇，E-mail：nbdyyycy@163.com.