乳腺癌患者血清中TBX3的表達及其與臨床病理特征的關(guān)系

丁金旺 羅定存 葉柳青 鄧甬川 王克義 張臥 潘鋼 周美琪 秦衛(wèi)民蔡菊芳

乳腺癌患者血清中TBX3的表達及其與臨床病理特征的關(guān)系

丁金旺 羅定存 葉柳青 鄧甬川 王克義 張臥 潘鋼 周美琪 秦衛(wèi)民蔡菊芳

目的 探討乳腺癌患者血清中TBX3的表達水平，探討其與臨床病理特征的關(guān)系。 方法 采用ELISA法檢測142例乳腺癌患者、70例乳腺良性疾病患者和80例健康女性血清中TBX3的表達水平，并比較3者之間的差異，分析血清TBX3與乳腺癌患者年齡、月經(jīng)狀態(tài)、組織學分級、腋窩淋巴結(jié)及遠處臟器轉(zhuǎn)移、TNM分期以及雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、人表皮生長因子受體2（Her-2）、細胞核增殖抗原（Ki-67）之間的相關(guān)性。結(jié)果 142例乳腺癌患者血清TBX3水平為2.13（1.01-6.15）ng/ml，顯著高于健康對照組[1.60（0.99-2.18）ng/ml]及良性對照組[1.58（0.71-3.18）ng/ml]，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或0.01）。血清TBX3表達水平與乳腺癌患者年齡、月經(jīng)無關(guān)，但隨著乳腺癌組織學級別增加、TNM分期進展、出現(xiàn)腋窩淋巴結(jié)及遠處臟器轉(zhuǎn)移而顯著升高。此外，ER陽性及Her-2過表達者血清TBX3表達水平較ER陰性及Her-2低表達者明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。Ki-67≥14%者與Ki-67＜14%者、PR陽性者與PR陰性者之間血清TBX3表達水平的差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。 結(jié)論血清TBX3在乳腺癌患者血清中高表達，且與乳腺癌組織學分級、TNM分期、腋窩淋巴結(jié)及遠處臟器轉(zhuǎn)移、ER及Her-2密切相關(guān)，提示血清TBX3可能可以作為乳腺癌臨床診斷、預后判斷及隨訪監(jiān)測的分子標記物。

乳腺癌 血清 TBX3 酶聯(lián)免疫吸附試驗 分子標記物

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率持續(xù)上升并呈年輕化，嚴重危害著廣大婦女的健康。乳腺癌受多種異常基因調(diào)控，特別是與原癌基因的激活和抑癌基因失活密切相關(guān)。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，在已確認的與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的諸多基因中，如p53、人表皮生長因子受體2（Her-2）等基因，人們又發(fā)現(xiàn)了一些新的基因，如TBX3。隨著研究的深入，TBX3已成為近年來乳腺癌研究領(lǐng)域的熱點。有研究證實，乳腺癌組織和細胞中存在TBX3高表達[1-2]，提示TBX3可能與乳腺的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。筆者采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法檢測并比較乳腺良、惡性疾病患者和健康女性血清中TBX3的表達水平，分析其與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系，以探討TBX3在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及臨床應用價值。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2010-09—2012-03杭州市第一人民醫(yī)院及浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院的212例乳腺疾病患者資料（杭州市第一人民醫(yī)院127例，浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院85例），包括年齡、月經(jīng)狀態(tài)、病理類型、組織學分級、腋窩淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移情況、臨床分期、雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、Her-2及細胞核增殖抗原（Ki-67）表達狀況等。患者均為女性，按組織病理學結(jié)果分兩組，即乳腺癌組與良性對照組。乳腺癌組142例，年齡30～80（50.98±9.57）歲；55.63%的患者未絕經(jīng)。根據(jù)美國AJCC第7版乳腺癌TNM分期標準[3]，0期2例，Ⅰ期15例，Ⅱ期41例，Ⅲ期20例，Ⅳ期64例；病理類型包括浸潤性導管癌130例，浸潤性小葉癌4例，導管內(nèi)癌2例，黏液癌2例，髓樣癌2例，神經(jīng)內(nèi)分泌癌1例，化生性癌1例。良性對照組70例，年齡28～69（46.46±9.58）歲；包括乳腺纖維腺瘤42例，乳腺增生性病變13例，導管內(nèi)乳頭狀瘤11例，分葉狀腫瘤2例，乳管擴張癥2例。另擇同期杭州市第一人民醫(yī)院行健康體檢的80例女性作為健康對照組，年齡22～81（42.05±14.69）歲。排除各種良、惡性腫瘤，且無先天性疾病史。均得到患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 血清標本收集與保存 采集患者術(shù)前或化療前空腹靜脈血4ml于血清分離管內(nèi)，室溫完全凝固，3 000r/min離心10min后分離血清，置于-70℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩＝】祵φ战M的血清標本采用同樣方法。

1.2.2 血清TBX3檢測 采用雙抗體夾心-ELISA法定量檢測上述各組血清TBX3的表達水平，試劑盒購自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司（產(chǎn)品編號：E97858Hu）。本研究采取盲法、復孔檢測，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.3 乳腺癌組織ER、PR、Ki-67陽性及Her-2過表達判斷標準 本研究采用S-P法檢測ER、PR、Ki-67及Her-2表達情況，ER、PR蛋白的表達以細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性染色，根據(jù)半定量法將結(jié)果分為“-”和“+～+++”4個級別，其中將“+”以上定義為陽性。Ki-67陽性細胞為核境界清晰的棕褐色顆粒沉著細胞，以切片中陽性細胞比例≥14%定義為陽性。Her-2蛋白的表達以細胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性染色，采用半定量法，結(jié)果分為“-”和“+～+++”4個級別，其中將“+++”定義為Her-2過表達，“+”及“-”定義為Her-2低表達，“++”進一步行免疫熒光原位雜交法（FISH）檢測，以Her-2基因/17號染色體比值＞2.2確定為過表達，否則為低表達。1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件。計量資料呈偏態(tài)分布，以M（QR）表示，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗。

2 結(jié)果

2.1 3組血清TBX3的表達水平的比較 見表1。

表1 3組血清TBX3的表達水平的比較

由表1可見，乳腺癌組血清TBX3的表達水平明顯高于健康對照組及良性對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或0.01），但在健康對照組與良性對照之間血清TBX3表達水平的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 乳腺癌患者血清TBX3表達水平與臨床病理特征的關(guān)系 見表2。

由表2可見，血清TBX3的表達在年齡≤50歲者與＞50歲者、絕經(jīng)前與絕經(jīng)后的乳腺癌患者中差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。與組織學1+2級患者相比，組織學3級的乳腺癌患者血清TBX3表達水平顯著增高，有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移者血清TBX3表達水平顯著高于無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移者，Ⅲ+Ⅳ期患者血清TBX3表達水平顯著高于0+Ⅰ+Ⅱ期患者，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或0.01）。以上結(jié)果表明，血清TBX3的表達與乳腺癌患者的年齡、月經(jīng)狀態(tài)無關(guān)，但與組織學分級、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)。

2.3 血清TBX3與乳腺癌常見分子標記物之間的關(guān)系 見表3。

由表3可見，142例乳腺癌患者ER、PR陽性率分別為69.01%（98/142）、67.61%（96/142），Her-2過表達率為33.10%（47/142）。142例乳腺癌患者中有94例進行了Ki-67的檢測，結(jié)果Ki-67≥14%者占62.77%（59/ 94）。ER陽性及Her-2過表達者血清TBX3表達水平較ER陰性及Her-2低表達者明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。Ki-67≥14%者血清TBX3表達水平雖然高于Ki-67＜14%者，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。PR陽性者與PR陰性者血清TBX3的表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 乳腺癌患者血清TBX3的表達水平與臨床病理特征的關(guān)系

表3 血清TBX3與乳腺癌常見分子標記物之間的關(guān)系

3 討論

TBX3基因是調(diào)控發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員之一，通過其表達產(chǎn)物TBX3蛋白調(diào)控哺乳動物的組織發(fā)育和細胞增殖。有研究表明，TBX3通過p19ARF（人p14ARF）/MdM2/p53和p21WAF1/CIP1等信號途徑抑制抑癌基因p53及p21的轉(zhuǎn)錄和表達。因此，TBX3持續(xù)表達或高表達時細胞將繞過衰老途徑而出現(xiàn)永生化和癌變，最終導致惡性腫瘤的發(fā)生。

現(xiàn)已明確，TBX3基因的缺失或突變是導致人類尺骨-乳腺綜合征（ulnar-mammary syndrome，UMS）的主要原因[1]，UMS是一種嚴重的常染色體顯性遺傳性疾病，乳腺發(fā)育障礙（包括發(fā)育不全和不發(fā)育）是該綜合征的重要特征，提示TBX3基因參與乳腺的正常發(fā)育。Platonova等[4]發(fā)現(xiàn)TBX3是調(diào)節(jié)乳腺細胞生長的轉(zhuǎn)錄因子，其表達水平調(diào)控著乳腺細胞增殖的程度。近年來的研究進一步顯示，TBX3在乳腺癌組織和細胞中均呈高表達，而大量表達的TBX3可以從乳腺癌組織和細胞中釋放入血并引起血TBX3水平升高[1-2]。本研究采用ELISA法檢測212例乳腺疾病患者和80例健康女性的血清TBX3水平，結(jié)果表明乳腺癌患者血清TBX3表達水平顯著高于良性對照組及健康對照組，而健康對照組與良性對照之間血清TBX3表達水平的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），和既往研究結(jié)果類似[5-6]。這不僅從血清學角度驗證了TBX3在乳腺癌的發(fā)生和演進過程中可能發(fā)揮著重要作用，而且說明血清TBX3的檢測或可成為臨床鑒別乳腺良、惡性疾病的一個新的診斷方法。

有文獻報道，隨著乳腺癌進展，TBX3在癌組織中的表達明顯增強[7]。陳忠華等[8]在TBX3與乳腺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)，有轉(zhuǎn)移的癌組織TBX3表達水平明顯強于非轉(zhuǎn)移的癌組織（P＜0.05）。而葉英海等[9]研究則顯示，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌組織中TBX3的陽性率為86.21%（25/29），明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陽性率58.33%（14/ 24）（P＜0.05）。本研究中乳腺癌患者伴有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移者血清TBX3表達水平顯著高于無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移者（P＜0.01），這說明血清TBX3和組織學TBX3一樣，其表達水平隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移而不斷升高。最近一些研究闡明了TBX3在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的機制，持續(xù)高表達的TBX3抑制鈣黏蛋白的表達，致使腫瘤細胞黏附性下降，細胞易于遷移和浸潤，從而出現(xiàn)轉(zhuǎn)移[2，10]。此外，筆者通過分析血清TBX3水平與TNM分期及組織分級的關(guān)系還發(fā)現(xiàn)，組織學3級、Ⅲ+Ⅳ期的乳腺癌患者血清TBX3水平較組織學1+2級、TNM分期0+Ⅰ+Ⅱ期患者顯著增高，這提示血清TBX3的表達水平與組織學分級、TNM分期也存在密切關(guān)系。而淋巴結(jié)(遠處)轉(zhuǎn)移、TNM分期及組織學分級等臨床病理因素均是判斷乳腺癌預后的重要依據(jù)，因此，筆者推斷血清TBX3表達水平不僅可以反映疾進展情況，還可以作為乳腺癌預后判斷及隨訪監(jiān)測的重要指標之一。

激素受體（ER、PR）和Her-2是目前臨床上判斷乳腺癌預后及指導治療方案最重要的分子標記物。本研究中，ER、PR陽性率分別為69.01%、67.61%，Her-2過表達率為33.10%，與Althuis等[11]和Fiegl等[12]的研究結(jié)果基本一致。有研究報道，TBX3的表達與激素受體及Her-2的狀態(tài)有關(guān)[9]。Fan等[13]對已知ER狀態(tài)的27例乳腺癌細胞株研究后發(fā)現(xiàn)，ER陽性的癌細胞TBX3的過表達比例及表達水平均高于ER陰性者。國內(nèi)葉英海等[9]研究發(fā)現(xiàn)，ER或Her-2陽性的乳腺癌組織中TBX3的陽性率明顯高于ER陰性者及Her-2陰性者（84.38%、57.14%，93.75%、64.86%）。而劉志祥[6]則認為TBX3的表達水平與Her-2過表達正相關(guān)，但與ER陽性表達負相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，ER陽性及Her-2過表達者血清TBX3表達水平較ER陰性及Her-2低表達者明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與上述文獻報道一致。Ki-67是乳腺癌細胞表達的一種核抗原，在乳腺癌診斷及判斷預后方面也具有重要意義[14]，因此，2011年的St.Gallen會議將Ki-67指數(shù)作為乳腺癌分子分型的指標之一[15]。本研究94例患者中，Ki-67陽性者為59例，陰性者為35例，血清TBX3水平在兩組間雖然未見統(tǒng)計學差異，但仍可見血清TBX3在Ki-67陽性組的表達高于陰性組的趨勢，可能與本組病例數(shù)不足有關(guān)，仍需進一步擴大樣本量進行深入研究。

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Serum TBX3 levels in patients with breast cancer and its relationship with clinicopathological characteristics

Objective To investigate serum T-box 3 (TBX3)levels in patients with breast cancer and its relationship with clinical and pathological characteristics.Methods Serum TBX3 levels were determined by Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)in 142 patients with breast cancer,70 patients with benign breast lesions and 80 healthy subjects.The correlations of serum TBX3 level with age,menstruation status,histological grade,axillary lymph node and distance metastasis,TNM staging and ER,PR,Ki-67,Her-2 levels were analyzed. Results The concentration of serum TBX3 was 2.13(1.01-6.15)ng/ml in patients with breast cancer and significantly higher than those in healthy subjects[1.60(0.99-2.18)ng/ml,P＜0.01]and patients with benign breast lesions [1.58(0.71-3.18)ng/ml,P＜0.05].Serum TBX3 levels in breast cancer patients were positively correlated with the histological grading,TNM staging,axillary lymph node and distance metastasis,but not correlated with the menstruation status and age of patients.Furthermore,serum TBX3 in ER positive and Her-2 over-expressed patients were significantly higher than those in ER negative and Her-2 low-expressed ones(P＜0.05),while there was no significant difference in serum Tbx3 between the PR positive and PR negative,Ki-67 positive and Ki-67 negative patients(P＞0.05). Conclusion Serum TBX3 is over-expressed in breast cancer,which is significantly correlated with histological grade,axillary lymph node and distance metastasis,TNM staging,ER and Her-2 status,indicating that it may serve as a biomarker for breast cancer and have potential clinical applications.

Breast cancerSerum T-box 3(TBX3) Enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)Biomarker

2012-11-01）

（本文編輯：嚴瑋雯）

杭州市科技發(fā)展計劃項目（20100633B05）

310006 杭州市第一人民醫(yī)院腫瘤外科（丁金旺、羅定存、張臥、潘鋼、秦衛(wèi)民），中心實驗室（王克義），體檢中心（蔡菊芳）；浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院腫瘤外科（鄧甬川、周美琪）；浙江省腫瘤醫(yī)院檢驗科（葉柳青）

羅定存，E-mail：ldc65@163.com