顱腦損傷后腦組織中水通道蛋白4表達的變化

潘紅松 湯崇輝 傅小君 許信龍 魏曉捷 方戰(zhàn)艦

顱腦損傷后腦組織中水通道蛋白4表達的變化

潘紅松 湯崇輝 傅小君 許信龍 魏曉捷 方戰(zhàn)艦

目的 研究顱腦損傷后水通道蛋白4（AQP-4）在腦組織中表達的變化及其臨床意義。 方法 對27例顱腦損傷患者行開顱手術，將術中取得的挫傷水腫腦組織（損傷組）和顳極減壓獲得的相對正常腦組織（對照組）進行AQP-4的免疫組化和real-time PCR檢測。結果 損傷組各時點挫傷水腫腦組織AQP-4的表達量均明顯高于對照組（均P＜0.05）；損傷24h后周圍水腫腦組織中的AQP-4表達量顯著升高。 結論 顱腦損傷后腦水腫的形成和發(fā)展與AQP-4的異常表達密切相關。

顱腦損傷 腦水腫 水通道蛋白4

腦水腫是顱腦創(chuàng)傷后最常見也是最嚴重的繼發(fā)性損傷，盡管以往有許多此類研究，但人們對其發(fā)生機制尚不清楚[1]。關于水通道蛋白4（aquaporin-4，AQP-4）在外傷性腦水腫中的作用，以往亦有許多研究，但結論并不一致，且大部分研究是以動物為研究對象，對人體的研究很少。本研究以急性顱腦損傷患者手術標本為研究對象，檢測并比較挫傷灶周圍水腫腦組織和顳極減壓獲得的正常腦組織中AQP-4的表達量，分析AQP-4與急性顱腦損傷后腦水腫的關系，探索其在腦水腫形成過程中的作用和規(guī)律，為臨床治療腦水腫提供理論依據。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇慈溪市人民醫(yī)院2010-01—2010-12因急性顱腦損傷住院手術治療的27例患者，其中男17例，女10例；年齡17～65歲，平均（38.6±11.5）歲；致傷原因為車禍傷20例，跌墜傷5例，打擊傷2例；術前GCS評分3～8分14例，9～12分9例，13～15分4例；受傷至手術時間＜6h9例，6～24h10例，＞24h8例。將開顱手術時切除的挫傷水腫的腦組織作為損傷組，顳極減壓時切除的相對正常的腦組織作為對照組。本研究方案得到醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的批準，治療措施均得到患者家屬的知情同意。

1.2 檢測儀器及材料 AQP-4一抗、兔三步法二抗均為美國SANTA CRUZ公司產品,由北京中杉金橋生物技術有限公司提供；反轉錄試劑盒（TAKARA）、定量試劑盒（TAKARA）由寶生物工程有限公司提供；定量PCR儀器ABI7500為美國應用生物系統(tǒng)公司生產。

1.3 標本采集 所有患者均行標準大骨瓣開顱術，顱骨鉆孔，銑刀銑開骨瓣，切開硬腦膜，清除血腫和挫傷腦組織，將取下的挫傷水腫的腦組織作為損傷組標本，同一患者顳極減壓獲得的相對正常腦組織作為對照組標本。每例標本均取兩份，一份放入4%的多聚甲醛溶液中固定24h后制作成蠟塊，用于免疫組化檢測；另一份保存于液氮罐中，用于real-time PCR檢測。

1.4 免疫組化檢測 石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化。抗原修復后3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶10min。滴加1︰60的AQP-4一抗4℃過夜,滴加山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體，37℃孵育40 min。二氨基聯苯胺顯色液顯色1～3 min，顯微鏡下控制反應。Harris蘇木素液復染細胞核1min。細胞膜呈黃色或黃棕色，細胞核呈藍色為陽性。每個石蠟塊任意選一張免疫組化染色切片，每張切片在挫傷與水腫帶交界區(qū)隨機選取3個高倍視野（×200），并拍照，用Image-ProPlus5.0專業(yè)圖像分析軟件進行圖像分析，測量免疫組化染色的平均光密度值（OD值)。OD值越大，AQP-4表達量越大。

1.5 real-time PCR檢測 Trirol試劑提取RNA，計算RNA含量及鑒定純度。然后逆轉錄為cDNA，再用特異性引物擴增目的基因。引物由上海輝睿生物科技有限公司設計合成（表1）。real-time PCR反應條件：預變性94℃5min，94℃變性15s，退火溫度下退火20s，60℃延伸45s，循環(huán)擴增40次，60℃檢測熒光值。反應結束后，由電腦自動得出熒光反應曲線，輸出各測量標本AQP-4和GAPDH的閾循環(huán)（threshold cycle，CT）值，以GAPDH為參照，計算方法為：△CT=CT（目的基因）-CT（參照基因GAPDH），△△CT=△CT（損傷組）-△Ct（對照組），2-△△CT表示目的基因RNA的相對量。

表1 目的基因的引物序列及反應條件

1.6 統(tǒng)計學處理 使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，所有計量資料用表示，組間比較采用t檢驗，組內不同時點的比較采用方差分析。

2 結果

2.1 免疫組化檢測 對照組腦組織細胞排列整齊。損傷組可見損傷中心細胞壞死，血管破裂出血，血管周圍呈空泡樣改變，神經細胞形態(tài)不整，排列紊亂，局部有大量小膠質細胞浸潤，周圍細胞水腫明顯，深部白質亦有出血、水腫表現。AQP-4主要分布于軟腦膜、與血管接觸的星形膠質細胞足突膜及腦室系統(tǒng)的室管膜上（圖1、2），損傷組挫傷周圍水腫腦組織中AQP-4的OD值均高于同一時點的對照組（P＜0.05），并且隨著時間的延長，AQP-4的表達量也增加（P＜0.01），而對照組各點AQP-4的表達量無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），詳見表2。

2.2 real-time PCR檢測 兩組腦組織中均檢測到AQP-4 mRNA的表達。對照組各時點AQP-4 mRNA的表達量無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。在同一時點，損傷組挫傷周圍水腫腦組織中AQP-4 mRNA的表達量均高于對照組（P＜0.01），并且隨著損傷時間的延長，AQP-4mRNA的表達量也增加（P＜0.01），詳見表3。

圖1 損傷組AQP-4免疫組化染色（×200）

圖2 對照組AQP-4免疫組化染色（×200）

表2 兩組標本AQP-4表達量的變化及比較

表3 兩組標本中AQP-4 mRNA表達量的變化及比較

3 討論

腦水腫是顱腦創(chuàng)傷后最常見也是最嚴重的繼發(fā)性損傷，其病理改變是過多的水分積聚在腦細胞內或細胞外間隙，引起腦體積增大、重量增加、顱內壓增高、腦疝甚至死亡。但目前對腦水腫的治療僅限于高滲性脫水和外科手術治療[2]。AQPs是近二十年來新發(fā)現的一個膜通道蛋白家族。迄今為止，已從哺乳動物組織中克隆出了13種水通道蛋白，它們廣泛分布于機體不同組織器官中，在介導水跨細胞膜的流動中起關鍵作用[3]。其中AQP-4在腦內分布廣泛，與腦水腫關系密切。參與出血性、缺血性腦水腫的形成,并在腦水腫形成過程中起關鍵性作用[4]。AQP-4是腦膠質細胞縫隙連接的組成部分[5]，與腦的血液灌注及水腫的形成和消退有著密切的關系，對調節(jié)體內水的代謝和維持中樞神經系統(tǒng)水代謝的平衡有重要的意義。AQP-4廣泛存在于星形膠質細胞和室管膜細胞，遍及全腦和脊髓，尤其是在緊貼腦脊液、腦室系統(tǒng)的軟腦膜和室管膜表面[6]。

Sun等[7]發(fā)現自由落體致大鼠腦損傷24h后，損傷區(qū)腦水腫程度最顯著，AQP-4的表達在損傷區(qū)腫脹的星形膠質細胞上明顯上調，在周邊臨近區(qū)下調，在遠處無明顯變化，因此認為AQP-4的上調可能是引起損傷區(qū)腦水腫的主要途徑和原因，AQP-4促進了腦水腫的形成。

雖然目前的實驗研究已較深入，但大多僅限于動物實驗，較少對臨床顱腦外傷標本進行AQP-4的檢測，了解其變化規(guī)律。根據CT影像學資料，急性顱腦損傷后，在挫傷腦組織周圍會形成一低密度的水腫帶，且隨著出血時間延長，水腫范圍逐漸擴大，最終導致腦組織受壓形成高顱內壓甚至腦疝，造成二次損傷。本研究結果顯示：在顱腦損傷后各個時點挫傷周圍水腫腦組織中AQP-4的表達量均顯著高于對照組的正常組織。并且隨著損傷時間的延長，AQP-4的表達量也增加，說明AQP-4的異常表達伴隨著腦水腫而存在。已有研究發(fā)現，顱腦損傷后腦組織含水量增加，AQP-4表達量增高，血-腦屏障通透性增加，三者的變化趨勢一致。而且AQP-4表達量的變化與血-腦屏障通透性增加呈正相關，這表明三者之間關系密切。顱腦損傷后AQP-4表達量上調可能引起血-腦屏障通透性增加，兩者的變化又導致腦組織含水量的增加[8]。

綜上所述，急性顱腦損傷后腦水腫的發(fā)生、發(fā)展與AQP-4的表達、血-腦屏障的通透性關系密切。AQP-4是水分子轉移的直接通路或載體，是膠質細胞與腦脊液以及血管之間的水調節(jié)和運輸的重要結構基礎，以AQP-4作為治療的靶向，可能有助于臨床上防止腦水腫的發(fā)生。Kleindienst等[9]用蛋白激酶C的激活劑調節(jié)AQP-4的表達并獲得成功。也有研究表明地塞米松在大鼠腦出血模型中下調了AQP-4的表達，從而降低了腦水腫的程度[10]。

腦水腫的形成是一種多機制、多因素參與的病理過程，AQP-4可能僅為其中重要的一個環(huán)節(jié)，其過程并未被完全闡明。目前對AQP-4與顱腦損傷后腦水腫關系的研究才剛剛起步，還需要有更多的基礎和臨床研究來證實。本研究以臨床患者的手術標本為研究對象，直接從臨床水平探討AQP-4與急性顱腦損傷腦水腫的關系，這對于急性顱腦損傷腦水腫的防治具有重要的臨床意義。

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Changes of aquaporin-4 expression in cerebral tissue after traumatic brain injury

Objective To assess the changes of aquaporin-4(AQP-4)expression in cerebral tissue after traumatic brain injury.Methods The cerebral tissue samples were obtained from 27 patients with traumatic brain injury during the operation,including contusive and edematous brain tissue(injury group)and the normal brain tissue in temporal pole after surgical depressurization(control group).The expressions of AQP-4 protein and mRNA in cerebral tissue samples were detected by immunohistochemieal technique and real-time PCR. Results The expression levels of AQP-4 protein and mRNA in the injury group were significantly higher than those in the control group(P＜0.05),particularly in the edematous tissues on 24h after traumatic injury. Conclusion The results suggest that the up-regulated expression of AQP-4 in the edematous brain tissues around the contusion may be involved in the formation and development of cerebral edema after traumatic brain injury．

Brain injury,traumatic Cerebral edema Aquaporin-4

2013-01-18）

（本文編輯：沈叔洪）

寧波市自然科學基金資助項目（2010A610065）；浙江省衛(wèi)生適宜技術成果轉化計劃（2011ZHA009）

315300 慈溪市人民醫(yī)院神經外科

湯崇輝，E-mail：tangegg@163.com