2型糖尿病大鼠肺組織凋亡相關因子Caspase表達及羅格列酮的干預作用研究

劉旭陽 ，王 綿，蘇勝偶，趙春芳

（1．中國人民解放軍第二五二醫院內分泌科，河北 保定 071000； 2．河北醫科大學第二醫院內分泌科，河北石家莊 050000； 3．河北醫科大學組胚教研室，河北 石家莊 050017）

近年來，隨著對糖尿病并發癥研究的深入，糖尿病肺部損害已經越來越受到關注。1型、2型糖尿病患者肺臟存在不同程度的限制性、阻塞性或混合性通氣及彌散障礙，但發病機制尚不清楚。本研究中通過檢測2型糖尿病大鼠肺組織細胞凋亡相關因子Caspase表達的變化，觀察羅格列酮的干預作用，為治療糖尿病肺病提供試驗依據。現報道如下。

1 材料與試藥

羅格列酮（葛蘭素史克公司，批號為0308002）；鏈脲佐菌素（Sigma公司，批號為S－130）；鹽酸氯胺酮（江蘇恒瑞醫藥公司，批號為 KH20045）；TUNEL檢測試劑盒（北京中山生物工程有限公司，批號為 10490800）；兔抗鼠 Caspase－3、Caspase－9 多克隆抗體（Santa Cruz公司，批號為 F00037626）。2周齡大鼠（體重180～250 g，河北省實驗動物中心提供）；全自動生化分析儀（德國拜耳）；血糖儀（美國強生）。

2 方法與結果

2．1 試驗分組

隨機選取10只大鼠作為對照組，給予普通飼料喂養；選取30只大鼠，高熱量飲食后給予腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素（STZ，30 mg ／kg），血糖不小于 7．8 mmol／L 者為模型組，從 12 周起每日給予同羅格列酮干預組等體積的高壓消毒水灌胃；選取模型組中大鼠作為干預組，給予羅格列酮灌胃治療[1．42 mg／（kg·d）]，至24周時進行標本收集及生化指標測定。

2．2 標本收集及生化指標測定

24周時對照組、模型組大鼠禁食12～14 h，測定血糖后，鹽酸氯胺酮100 mg／kg腹腔注射麻醉，股靜脈取血測定胰島素和血脂。打開胸腔，迅速取出肺臟，冰鹽水沖洗，剪除胸膜及血管，取部分肺組織置10%中性甲醛固定，脫水，石蠟包埋，常規切片留做HE染色；用TUNEL試劑盒檢測肺組織細胞凋亡，棕黃色或黃色為陽性反應；下一步分別加一抗[兔抗 Caspase－3（1∶100），兔抗Caspase－9（1 ∶100）]，用 PBS 清洗后，滴加生物素標記的二抗工作液（兔抗羊），滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素工作液（三抗），陰性對照用PBS替代一抗，觀察細胞漿和／或細胞核內表達，棕黃或黃色顆粒為陽性反應。

2．3 統計學處理

采用 SPSS 10．0軟件進行統計學處理，組間比較采用 t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 q檢驗，所有計量資料以（X±s）表示，P＜0．05為差異有統計學意義。

2．4 結果

生化指標改變：見表1。24周時糖尿病模型組大鼠的空腹血糖、胰島素、甘油三酯、膽固醇較同期對照組均顯著升高（P＜0．05）。羅格列酮干預組大鼠甘油三酯、膽固醇下降，但無統計學意義，胰島素明顯下降，與糖尿病模型組大鼠相比，胰島素水平有顯著差異（P ＜0．05）。

表1 干預的不同階段生化和胰島素水平比較（X±s）

肺組織形態學變化：HE染色可見，對照組大鼠肺泡分布均勻，結構完整，由單層肺泡上皮和基膜組成，相鄰肺泡之間有少量結締組織。糖尿病模型組大鼠肺組織結構紊亂，支氣管壁、肺泡壁增厚，肺泡上皮細胞顯示不清，肺泡萎縮、塌陷。肺間質和血管周圍細胞外基質大量增多，成纖維細胞增多，并有大量炎癥細胞浸潤。羅格列酮治療組大鼠肺組織病變較糖尿病模型組明顯減輕，肺間質膠原沉積較少，支氣管、肺泡上皮細胞壁增厚減輕，介于對照組和糖尿病模型組之間（P＜0．01）。糖尿病模型組大鼠肺組織結構紊亂，支氣管壁、肺泡壁增厚，肺泡上皮細胞顯示不清，肺泡萎縮、塌陷。并有大量炎癥細胞浸潤。羅格列酮干預組大鼠肺組織病變較糖尿病模型組明顯減輕，肺間質膠原沉積較少，支氣管、肺泡上皮細胞壁增厚減輕，介于對照組和糖尿病模型組之間（P＜0．05）。見圖1。

圖1 大鼠肺組織HE染色（SP×200）

Caspase－3免疫組化結果：對照組大鼠的支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞、少數血管內皮細胞胞核可見少量陽性表達。24周糖尿病模型組大鼠陽性表達明顯增加，見于支氣管細胞、肺泡上皮細胞、肺巨噬細胞及炎性細胞，胞膜及胞漿表達，陽性染色光密度值為 0．141 2 ±0．001 2，明顯高于同期對照組的 0．073 8 ±0．006 5（P ＜0．01）；羅格列酮干預組陽性染色光密度值為 0．129 3 ±0．004 6，大于對照組，少于24周糖尿病模型大鼠組，組間均有明顯差異（P ＜0．01）。肺組織凋亡指數對照組為 0．079 5±0．016 2，羅格列酮干預組為 0．170 9±0．014 0，糖尿病模型大鼠組為0．244 7 ±0．0123，組間比較差異有統計學意義（P ＜0．01）。見圖 2。

圖2 不同分組大鼠肺組織Caspase-3表達（SP×400）

Caspase－9免疫組化結果：對照組大鼠的支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞胞漿中可見少量陽性反應。24周糖尿病模型組大鼠陽性表達明顯增加，見于支氣管細胞、肺泡上皮細胞、肺巨噬細胞及炎性細胞，胞膜及胞漿表達，陽性染色光密度值為0．255 2±0．009 6，明顯高于同期對照組大鼠的光密度值 0．083 2±0．019 2（P＜0．01）。羅格列酮治療組陽性染色光密度值為 0．226 1±0．011 8，大于對照組，少于24周糖尿病模型組，組間均有明顯差異（P ＜0．01）。見圖 3。

圖3 不同分組大鼠肺組織Caspase-9表達（SP×400）

3 討論

噻唑烷二酮類降糖藥物（TZDs）是一類過氧化物酶體增殖物活化受體 γ（PPAR－γ）激動劑。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR－γ）是核激素受體蛋白超家族成員。它通過連接到目標基因增強子序列上的過氧化物體增殖反應元件，調節目標基因的轉錄活性。羅格列酮是噻唑烷二酮類降糖藥，它通過與過氧化物酶體增殖物活化受體γ結合，增加肝臟、骨骼肌及脂肪組織對胰島素的敏感性，從而降低血糖。此外，羅格列酮還具有抗氧化、改善血管內皮功能等作用[1－2]。筆者選用羅格列酮來觀察其對糖尿病肺組織凋亡的作用。

試驗采用高脂高糖飲食加小劑量STZ模擬人類2型糖尿病的發病過程，建成2型糖尿病大鼠模型，分別觀察不同試驗組肺組織病理改變及凋亡細胞的變化。結果發現，羅格列酮治療組大鼠空腹血糖未降低，但甘油三酯、胰島素及膽固醇水平明顯低于糖尿病大鼠組；糖尿病大鼠肺組織的病理改變明顯減輕，光鏡下支氣管、肺泡、血管基底膜增厚減輕，肺組織結構好轉。同時，羅格列酮治療組凋亡細胞數低于糖尿病模型組，表明羅格列酮抑制了糖尿病大鼠肺組織中的細胞凋亡。

PPAR－γ在肺中分布較廣，Ⅱ型肺泡上皮細胞只表達亞型PPAR － γ1，肺組織中主要表達 PPAR － γ1[3－4]。國外研究顯示，PPAR－γ的激活可抑制視網膜、血管平滑肌及多種腫瘤細胞的凋亡[5]。也有研究表明，羅格列酮對糖基化終產物誘導的心肌成纖維細胞凋亡有抑制作用[6]。對于糖尿病大鼠肺組織細胞凋亡是否有抑制作用，目前國內未見報道。本研究結果顯示，羅格列酮抑制了肺組織細胞凋亡，其機制尚不明確，需進一步試驗研究。

[1]郭嘯華，劉志華，李 恒．高糖高脂飲食誘導的2型糖尿病大鼠模型及其腎并特點[J]．中國糖尿病雜志，2002，10 （5）：290-294．

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[3]Hsueh WA，Bruemmer D．Peroxisome Proliferator-activated receptor gamma：implications for cardiovascular disease[J]．Hypertension，2007，43（19）： 297-305．

[4]李惠萍，李 霞，何國钅勻，等．地塞米松對博萊霉素致肺間質纖維化大鼠肺內炎性細胞的影響[J]．復旦學報：醫學版，2004，31(4)：378-382．

[5]張靜萍，萬建華，劉國良．核因子在糖尿病大贖肺組織活性的變化[J]．中國老年病學雜志，2005，7（25）：820-822．

[6]吳 亮，朱忠華，易 燁，等．褪黑素對高糖誘導的大鼠系膜細胞凋亡的影響[J]．中國中西醫結合腎病雜志，2007，9（8）：514-516．