復(fù)方阿莫西林鹽酸氨溴索血藥濃度測(cè)定及藥代動(dòng)力學(xué)研究

宋金春，陳 杏，周 妮

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢 430060）

阿莫西林（amoxicillin）是一種廣譜半合成β－內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物，臨床廣泛用于治療急慢性呼吸道感染，也可用于中耳炎、咽炎、肺炎和扁桃體炎。鹽酸氨溴索（ambroxol）是一種黏痰溶解劑，可降低痰黏度，稀釋痰液，使其易于咳出，并減少過(guò)敏物質(zhì)的釋放，改善呼吸狀況。臨床研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸氨溴索可增加阿莫西林在肺部的濃度[1－3]。目前，國(guó)內(nèi)尚未有阿莫西林鹽酸氨溴索的復(fù)方制劑上市。本試驗(yàn)中主要建立了復(fù)方阿莫西林鹽酸氨溴索膠囊在家兔血清中的測(cè)定方法，并對(duì)其藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究，為臨床制訂合理的給藥方案提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Thermo Forma 700系列超低溫冰箱（美國(guó) Thermo公司）；XW－80A型渦旋儀（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠(chǎng)）；Sorvall Pico（非冷凍型）微量臺(tái)式離心機(jī)，Sorvall Fresco（冷凍型）微量臺(tái)式離心機(jī)（德國(guó)賀利氏公司）；BF2000水浴氮?dú)鈸]干儀（北京八方實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；YXJ－1型高速離心機(jī)（深圳天南海北實(shí)業(yè)有限公司）；Agilent 1100型高效液相色譜儀（配四元梯度泵、DAD檢測(cè)器、G137PA自動(dòng)脫氣機(jī)、標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、色譜工作站，美國(guó)Agilent公司）；TG328A型電子分析天平（上海天平儀器廠(chǎng)）。阿莫西林對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為130409－201011）；阿莫西林原料藥（珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司，批號(hào)為3081032049，含量為100．1%）；鹽酸氨溴索原料藥（北京太洋藥業(yè)有限公司，批號(hào)為M100405，含量為99．43%）；復(fù)方阿莫西林鹽酸氨溴索膠囊（武漢大學(xué)藥學(xué)院臨床藥物研究所，規(guī)格為阿莫西林250 mg＋鹽酸氨溴索15 mg）；阿莫西林膠囊（昆明貝克諾頓制藥有限公司，含阿莫西林250 mg，批號(hào)為110205）；鹽酸氨溴索膠囊（日本獨(dú)資四川大冢制藥有限公司，規(guī)格為30 mg，批號(hào)為101103）；甲醇（色譜純）；醋酸銨（分析純）；醋酸（分析純）。雄性新西蘭兔 12 只（普通級(jí)），體重（2．0 ± 0．2）kg，武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（合格證號(hào)為00018395）。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Inertsil ODS－2 柱（150 mm ×4．6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇－0．01 mol／L醋酸銨溶液（以醋酸溶液調(diào)節(jié) pH至 4）＝8 ∶92；檢測(cè)溫度：25 ℃ ；檢測(cè)波長(zhǎng)：244 nm；流速：1．0 mL ／min；進(jìn)樣量：20 μL。

2．2 溶液制備

精密量取阿莫西林對(duì)照品10．0 mg，置50 mL容量瓶中，以甲醇溶解并稀釋定容至刻度，搖勻，即得 200 μg／mL的對(duì)照品溶液，使用前稀釋。

2．3 血樣預(yù)處理

精密吸取家兔血樣400 μL，置2 mL肝素化離心管中，加入200 μL 甲醇沉淀蛋白，渦旋震蕩 1 min，12 000 r／min 離心 15 min，取上清液經(jīng)0．45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液20 μL進(jìn)樣。

2．4 方法學(xué)考察

專(zhuān)屬性考察：分別取經(jīng)2．3項(xiàng)操作后得到的家兔空白血清溶液，加阿莫西林對(duì)照品的空白血清和家兔給藥4 h后血清溶液20 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，用上述血樣預(yù)處理方法處理空白血樣和含藥血樣，在阿莫西林出峰處無(wú)干擾，血清中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾阿莫西林的測(cè)定，阿莫西林的保留時(shí)間為3．9 min，說(shuō)明此方法的專(zhuān)屬性好。

圖1 高效液相色譜圖

線(xiàn)性關(guān)系考察：分別取阿莫西林對(duì)照品溶液適量，氮?dú)獯蹈桑尤?00 μL家兔空白血清，渦旋混合，配成血清中含對(duì)照品質(zhì)量濃度分別為 200，150，100，75，50，25，18．75，12．5 μg ／mL 的系列含藥標(biāo)準(zhǔn)血清樣品。按2．3項(xiàng)下方法操作，以阿莫西林的峰面積為縱坐標(biāo)（Y）、血清中對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程 Y＝3．605 X －2．457，r＝0．999 6（n＝8）。結(jié)果表明，阿莫西林質(zhì)量濃度在 12．5～200 μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：分別取阿莫西林對(duì)照品溶液適量，氮?dú)獯蹈桑尤?00 μL家兔空白血清，渦旋混合，配成低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度（12．5，75，200 μg ／mL）的對(duì)照品血清溶液，每一濃度平行配制5份，在日內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定，考察日內(nèi)精密度。連續(xù)測(cè)定3 d，考察日間精密度。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取空白血清并精密加入阿莫西林對(duì)照品溶液，配成 12．5，75．00，200．00 μg／mL 的對(duì)照品血清，按 2．3 項(xiàng)下進(jìn)行處理后，分別考察在－20℃環(huán)境中放置3 d和反復(fù)凍融3次的穩(wěn)定性。結(jié)果的 RSD分別為 1．0% ～8．2%和 1．2% ～7．3%。

回收率試驗(yàn)：分別取阿莫西林對(duì)照液適量，氮?dú)獯蹈桑尤?00 μL家兔空白血清，渦旋混合，配成低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度（12．5，75，200 μg ／mL）的對(duì)照品血清溶液，每一濃度平行配制3份，按2．3項(xiàng)下方法測(cè)定，依據(jù)線(xiàn)性回歸方程計(jì)算各自的質(zhì)量濃度，以測(cè)定質(zhì)量濃度和真實(shí)質(zhì)量濃度之比計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

2．5 藥代動(dòng)力學(xué)研究

將12只雄性新西蘭兔隨機(jī)分為甲、乙兩組，每組6只，試驗(yàn)前禁食12 h，甲組家兔灌服受試制劑A（自制復(fù)方阿莫西林鹽酸氨溴索膠囊，2粒），乙組家兔灌服對(duì)照制劑B（阿莫西林膠囊2粒＋鹽酸氨溴索膠囊 1 粒），分別在給藥后 0．25，0．5，0．75，1，1．5，2，3，4，5，6，8，12 h 時(shí)從耳緣靜脈處取血 2 mL，置肝素化離心管中，12 000 r／min離心 10 min，取上清液，于 －20℃放置，待測(cè)。按上述方法測(cè)定樣品，計(jì)算阿莫西林血藥濃度，繪制藥時(shí)曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖3，將所得各組藥物濃度－時(shí)間數(shù)據(jù)分別輸入3P97藥代動(dòng)力學(xué)軟件，根據(jù) AIC（AKaike′s information criterion）最小原則選擇最佳房室模型和權(quán)重，確定藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明，復(fù)方阿莫西林鹽酸氨溴索膠囊與同時(shí)服用兩單藥膠囊在家兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程均符合一室模型，權(quán)重系數(shù)為1／C2，藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表3。

圖2 家兔口服藥物后平均血藥濃度-時(shí)間曲線(xiàn)（n＝12）

表3 口服復(fù)方阿莫西林膠囊后的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

3 討論

3．1 液相條件選擇

參照文獻(xiàn)[4－8]對(duì)試驗(yàn)方法進(jìn)行摸索，筆者對(duì)不同的流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行了嘗試。以甲醇 －水（10∶90）為流動(dòng)相時(shí)，阿莫西林約在5．5 min時(shí)出峰，但峰形不佳。以甲醇磷酸鹽系統(tǒng)和乙腈－磷酸鹽系統(tǒng)為流動(dòng)相時(shí)，若將有機(jī)相比例調(diào)高，則阿莫西林出峰時(shí)間過(guò)早以至與內(nèi)源性物質(zhì)無(wú)法分開(kāi)；若將其比例稍微調(diào)低，則出峰時(shí)間又推遲至10 min左右。相比而言，文中采用甲醇－0．01 mol／L醋酸銨溶液（8∶92）為流動(dòng)相時(shí)，可以獲得比較滿(mǎn)意的峰形，出峰時(shí)間較短，約在4 min，并且與內(nèi)源性物質(zhì)的分離度較好。最終選擇甲醇 － 0．01 mol／L 醋酸銨溶液（8 ∶92）作為流動(dòng)相。

3．2 劑量確定

試驗(yàn)動(dòng)物與人的給藥劑量之間存在著換算關(guān)系，試驗(yàn)動(dòng)物給藥劑量＝人的給藥劑量×人的體重×折算系數(shù)／試驗(yàn)動(dòng)物的體重。按照成年人1次服用500 mg阿莫西林，換算得到1只家兔的給藥劑量應(yīng)為70 mg，但在此劑量下只能在1．5 h和2 h處檢測(cè)到血藥濃度，其他時(shí)間點(diǎn)均無(wú)法檢測(cè)。當(dāng)家兔的給藥劑量為250 mg時(shí)，只能檢測(cè)到 1，1．5，2，3 h這 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度。當(dāng)給藥劑量定為500 mg時(shí)，可以檢測(cè)到所有時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度，給藥后1 h內(nèi)家兔沒(méi)有出現(xiàn)異常反應(yīng)。

藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較：由于家兔個(gè)體間存在差異，本試驗(yàn)僅對(duì)其平均血藥濃度－時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。擬合結(jié)果表明，受試制劑A（復(fù)方阿莫西林鹽酸氨溴索膠囊）與對(duì)照制劑B（阿莫西林膠囊2粒＋鹽酸氨溴索膠囊1粒）的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程均符合一室模型，權(quán)重系數(shù)為1／C2，達(dá)峰濃度（Cmax）受試制劑 A大于對(duì)照制劑B，藥時(shí)曲線(xiàn)下面積（AUC）數(shù)據(jù)顯示受試制劑A的生物利用度較對(duì)照制劑B高。說(shuō)明復(fù)方阿莫西林鹽酸氨溴索膠囊比同時(shí)服用兩單藥膠囊吸收更好。由于該復(fù)方膠囊中氨溴索含量相對(duì)阿莫西林偏低，經(jīng)體內(nèi)代謝后檢測(cè)到的血藥濃度不穩(wěn)定，故本試驗(yàn)主要以阿莫西林體內(nèi)血藥濃度對(duì)其藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行評(píng)價(jià)，為復(fù)方阿莫西林鹽酸氨溴索膠囊藥代動(dòng)力學(xué)的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

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