高效液相色譜法測定蓮膽消炎片中穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯含量

陸 瀅

（江蘇省鹽城市第一人民醫院藥劑科臨床藥學室，江蘇 鹽城 224000）

蓮膽消炎片由穿心蓮和苦木組方，功效為清熱解毒、涼血消腫，用于感冒發熱、咽喉腫痛、口舌生瘡、頓咳勞嗽、熱淋澀痛[1]。根據1995年版《中國藥典》1997年增補版本中對蓮膽消炎片的標準，在其檢查項中只對穿心蓮內酯作了規定（即要求每片含總內酯以穿心蓮內酯計，不得少于18 mg），未對脫水穿心蓮內酯的含量作出規定，這樣不易于對蓮膽消炎片的質量進行有效控制[2]。筆者認為，可根據2010年版《中國藥典(一部)》中對穿心蓮的質量要求，建立用于蓮膽消炎片中穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯含量測定的高效液相色譜法，從而控制蓮膽消炎片的質量。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相測定儀；G1314B型紫外檢測器；Agilent色譜工作站；BP 211D型電子天平；TB224S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）。穿心蓮內酯對照品（批號為110797-200307），脫水穿心蓮內酯對照品（批號為 110854-200306）均來自中國藥品生物制品檢定所；蓮膽消炎片（批號分別為 20100101，20100309，20100716，20101103，20101201，江西恒康藥業有限公司）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2．1 色譜條件及系統適用性試驗

色譜柱：Agilent C18柱（150 mm × 4．6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 - 水（52 ∶48）；穿心蓮內酯的流速：0．8 mL ／min，進樣量：10 μL，檢測波長：225 nm；脫水穿心蓮內酯的流速：0．8 mL／min，進樣量：10 μL，檢測波長：254 nm。理論板數按穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯峰計算均應不低于2 000。

2．2 溶液制備

分別取穿心蓮內酯對照品和脫水穿心蓮內酯對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL各含0．1 mg的混合溶液，即得對照品溶液（貯備液）[3]。取蓮膽消炎片10片除去糖衣，精密稱定，研細，取適量，精密稱定1．0 g，置三角瓶中，精密加入40%的甲醇25 mL，稱定質量，浸泡 1 h，超聲處理（功率 250 W，頻率 33 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用40%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液10 mL，置中性氧化鋁柱（200到300目，5 g，內徑為1．5 cm），用甲醇15 mL洗脫，收集洗脫液，置50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2．3 方法學考察

專屬性試驗：取不含穿心蓮的模擬制劑制備的陰性對照品溶液，在上述色譜條件下進樣測定。結果，在與穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯對照品溶液峰相同位置，供試品溶液有色譜峰出現，色譜峰與其相鄰峰能完全達到基線分離。陰性對照品溶液在穿心蓮內酯和脫水穿心蓮峰相應位置無干擾。高效液相色譜圖見圖1。

線性關系考察：精密量取穿心蓮內酯對照品溶液（貯備液）適量共5份，分別置10 mL容量瓶中，加入甲醇溶液稀釋定容，使質量濃度分別稀釋 2，4，8，80倍，將上述 5份溶液和原對照品貯備液各精密量取10 μL注入色譜柱。以穿心蓮內酯峰面積(A)為縱坐標、質量濃度(C，μg）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程 C=26．395 030 12 A-13．301 027 15， r=0．999 9。結果表明，穿心蓮內酯進樣量在5～400 μg范圍內與峰面積線性關系良好。平均回收率為97．74%。精密量取脫水穿心蓮內酯對照品溶液（貯備液）適量共5份，分別置10 mL容量瓶中，加入甲醇溶液稀釋定容，使質量濃度分別稀釋 2，20，100，500倍，上述 5份溶液和原對照品貯備液各精密量取 10 μL注入色譜柱。以脫水穿心蓮峰面積(A)為縱坐標、質量濃度(C，μg）為橫坐標進行線性回 歸，得 回歸方程 C=17．341 648 01 A＋9．001 333 10，r=0．999 9。結果表明，脫水穿心蓮內酯進樣量在 3～1 535 μg范圍內與峰面積線性關系良好。

圖1 高效液相色譜圖

精密度試驗：精密吸取同一穿心蓮內酯對照品溶液和脫水穿心蓮內酯對照品溶液，分別連續重復進樣5次。結果穿心蓮內酯RSD為0．9%，脫水穿心蓮內酯的 RSD為0．7%，表明該方法的精密度良好。

檢測限考察：取穿心蓮內酯對照品溶液（0．1 g／L）逐步稀釋，在 S／N=10時，穿心蓮內酯檢測限約為 0．5 ng。取脫水穿心蓮內酯對照品溶液（0．08 g／L）逐步稀釋，在 S ／N=10 時，脫水穿心蓮內酯檢測限約為3．2 ng。

穩定性試驗：精密量取含穿心蓮內酯0．100 9 g／L的對照品溶液，按擬訂方法操作，隔4 h測1次，共測5次，計算含量，結果的日內 RSD為0．47%。另取上述不同質量濃度的溶液，同法處理，周內重復測定3次，日間 RSD為0．89%。精密量取含脫水穿心蓮內酯0．003 2 g／L的對照品溶液，按擬訂方法操作，隔4 h測1次，共測5次，計算含量，結果的日內 RSD為0．39%。另取上述不同質量濃度的溶液，同法處理，周內重復測定3次，結果的日間RSD 為 0．91%。

2．4 樣品含量測定

分別精密量取處理好的樣品溶液10 μL注入色譜柱，測得樣品中穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯峰面積，由標準曲線方程計算蓮膽消炎片中穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯的含量，見表1。樣品測定結果表明，蓮膽消炎片中穿心蓮內酯在穿心蓮中的含量為1．39%，脫水穿心蓮內酯在穿心蓮中的含量為1．97%。該值符合2010年版《中國藥典(一部)》限定穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯在穿心蓮的含量不得少于0．8%的規定。

表1 蓮膽消炎片含量測定結果（n＝6）

3 討論

穿心蓮的有效成分為二萜內酯類和黃酮類化合物，主要有穿心蓮內酯，脫水穿心蓮，新穿心蓮內酯，去氧穿心蓮內酯等成分[4]，具有細胞分化誘導、保肝降酶作用[5]，提高膽汁分泌量，并改變其物理特性等藥理作用[6]。試驗中收集了不同產地的穿心蓮藥材，并對其中的脫水穿心蓮內酯的含量測定方法進行了研究，除超聲時間增加到60 min外，測定方法和制劑測定方法都相同。用本法測定的5批藥材的結果與1995年版《中國藥典》中收載的薄層掃描測定結果比較，兩種方法測定的結果差異不大。而不同批號藥材的測定結果差異較大，鑒于大生產中的原材料受產地、來源、品種等因素的影響，使得制劑測定結果有較大差異，故對穿心蓮材料中脫水穿心蓮內酯的含量應該做限度規定[7]。

脫水穿心蓮內酯易于溶解在有機溶劑中，對比了甲醇、乙醇和醋酸乙酯的提取效果，甲醇的提取所測得的含量高，故選用甲醇作為提取溶劑。同時根據文獻[8]，以乙酸乙酯、甲醇為溶劑提取進行比較，結果因甲醇提取時間短，測定時雜質峰干擾少，故以甲醇提取時含量測定方法的回收率高、精密度好，重現性也好。

穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯分子極性較強，比較適合用于高效液相色譜分析，常用的流動相有甲醇-水-氯仿-三乙胺系統、甲醇-水-氯仿 -二乙胺系統和甲醇-水-乙腈系統等。根據本品情況及查閱相關文獻，甲醇可以滿足穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯與雜質峰的分離，且得到較好的峰形。故選擇了甲醇-水溶液（52∶48）作為流動相，得到了較好的分離效果。

文獻報道穿心蓮內酯在200～250 nm波長處有較大吸收[9]，用紫外分光光度與200～400 nm處掃描穿心蓮內酯對照品溶液，結果顯示在225 nm處有最大吸收峰，極限也較穩定。同樣，脫水穿心蓮內酯在254 nm處測定效果最佳。

有文獻報道，穿心蓮貯存年份越久，穿心蓮內酯的含量則越低[10]。存放1年后，穿心蓮內酯的含量可降低 50% ～80%。但另1篇文獻報道，將新采收的穿心蓮葉曬干并室溫存放1年后，再測定穿心蓮內酯的含量，結果與新采收時的含量基本一樣，沒有降低[11]。兩種方法提示，穿心蓮內酯含量的降低可能與其水分的含量成正比，這還需深入研究。

[1]王文采．中國植物志（第27卷）[M]．北京：科學出版社，1979：27．

[2]國家藥典委員會．中華人民共和國藥典（一部）[M]．北京：化學工業出版社，1995：127．

[3]國家藥典委員會．中華人民共和國藥典（一部）[M]．北京：中國醫藥科技出版社，2010：794．

[4]Matsuda T，Kuroyanacii M．Cell differentiutiorr inducing diterpents from Andrographis paniculata Nees[J]．Chem Pharm Bull，1994，42（6）：1 216．

[5]Kapil A，Koul IB，Banerjee SK，et al．Antiherpatotoxic effets of major diterpenoid constituentsofAndrogrophis paniculata[J]．Biochemical Pharmacology，1993，46（1）：182．

[6]Tripathi GS，Tripathi YB．Choleretic action of andrographolide obtained from Andrographispaniculata Nees[J]．Phytatherapy Research，1991，5（4）：176．

[7]王永林，陶 玲，周寶珠，等．高效液相色譜法測定消炎利膽膠囊中脫水穿心蓮內酯的含量[J]．藥物分析雜志，2000，1（20）：97．

[8]陳敏武，徐德然，王崢濤，等．RP-HPLC法測定不同產地及采收期的穿心蓮內酯中穿心蓮內酯和新穿心蓮內酯的含量[J]．中國藥科大學學報，1999，30（4）：291-293．

[9]孫春燕．高效液相色譜法測定消炎利膽膠囊中穿心蓮內酯的含量[J]．中國中醫藥現代遠程教育，2008，6（9）：187．

[10]陳敏武，徐德然，王 崢，等．消炎利膽膠囊中脫水穿心蓮內酯的含量研究[J]．中國藥科大學學報，1999，30（4）：131．

[11]金文姍，經 晶．HPLC法測定穿心蓮及其提取物中穿心蓮內酯的含量[J]．中藥研究與信息，2001，3（8）：135．