四逆散對應激性肝郁小鼠的保護作用機制研究

郭青文 ，何 銀 ，何蓉蓉

(1．江西省遂川人民醫院，江西 吉安 343900;2．暨南大學，廣東 廣州 510632)

四逆散是出自《傷寒論》的經典名方，由柴胡、枳實、白芍、甘草按1∶1∶1∶1組成的散劑，近代醫家用作湯劑，以水煎服。四逆散是疏肝解郁、調和肝脾的組方，主治陽郁厥逆、肝脾氣郁等[1]。臨床研究表明，四逆散對肝炎、纖維化和肝硬化有較好的預防和治療效果[2-3]。現代藥理學研究表明，四逆散不僅有保肝作用[4]，并有較好的抗抑郁作用[5]。但關于四逆散抗抑郁與保肝作用之間的聯系并不清楚，其疏肝解郁的作用機制也不明確。本研究中利用小鼠拘束應激負荷模型評價了四逆散湯劑的疏肝解郁作用，并通過檢測應激性激素水平以及肝臟炎癥、氧化水平的變化探討其可能的作用機制，為四逆散的臨床使用提供實驗依據。

1 材料與方法

1．1 實驗材料

試藥:四逆散是由康美藥業股份有限公司提供的柴胡、枳實、白芍、炙甘草各250 g，加10倍量水浸泡20 min、煮沸60 min、提取3次合并濾液濃縮而成(提取率為15．62%)。丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬酸氨基轉移酶(AST)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)及考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所;甲醇為色譜純，江蘇漢邦科技有限公司產品;6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid(Trolox，為維生素E的水溶性衍生物)、2，2'-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride(AAPH)、熒光素鈉(sodium fluorescein)均為日本和光純藥株式會社產品(Wako Pure Chemical Industries， Ltd，Osaka， Japan)。

實驗動物:SPF級7～9周齡昆明種小鼠，雄性，體重18～22 g，購自廣東省醫學實驗動物中心，動物實驗許可證號SCXK(粵)2008-0002。實驗動物在清潔級層流架中飼養，環境溫度(23±2)℃，照明時間每日12 h(7:00-19:00)。飼養1周后進行試驗。

1．2 試驗方法

拘束應激負荷小鼠模型建立:將昆明小鼠隨機分為空白對照組(C組)、應激模型組(M)組、應激模型＋維生素C對照組(P組)、應激模型＋四逆散高劑量組(SH組，1 000 mg/kg)、應激模型＋中劑量組(SL組，565 mg/kg)共5組，每組10只。小鼠連續灌胃給藥1周，試驗第6天時給予小鼠一次性拘束應激18 h(14:00～8:00)。期間所有小鼠禁食禁水。拘束18 h后，小鼠乙醚麻醉，心臟采血后置肝素處理的離心管中，5 000 r/min離心5 min，分離血漿儲存在-20℃備用。取小鼠肝臟以生理鹽水制成10%勻漿，12 000 r/min離心15 min后取上清液，用于測定生化指標。

血漿ALT和AST測定:ALT和AST水平根據試劑盒說明書測定[6]。

小鼠血漿皮質酮(CORT)測定:將小鼠全血置肝素處理的離心管中，5 000 r/min離心5 min，分離血漿，加入適量內標物皮質醇，用1．5 mL乙酸乙酯萃取，1 500 r/min離心5 min，收取上層乙酸乙酯液，下層再加1 mL乙酸乙酯萃取2遍，合并3次乙酸乙酯萃取液，用0．1 mol/L氫氧化鈉溶液2 mL洗滌，再用1 mL蒸餾水洗滌2次，用氮氣吹干乙酸乙酯液，加80 μL流動相溶解樣品提取物。按Wood等[7]的方法，采用高效液相色譜(HPLC)內標法(內標物為皮質醇)測定血漿中CORT水平。HPLC檢測條件為Hitachi高效液相色譜系統(包括L-6200型輸液泵、L-5020型柱溫箱、L-4000型紫外檢測器、N2000色譜數據工作站)，檢測波長為 254 nm，色譜柱為 5C18柱(150 mm ×4．6 mm，5 μm)，流動相為38%乙腈-水，流速1 mL/min。

小鼠肝組織抗氧化能力指標(ORAC)、MDA、一氧化氮(NO)測定:小鼠肝組織ORAC參考文獻[8]方法測定。小鼠肝組織的氧化損傷產物MDA水平采用南京建成試劑盒測定。小鼠肝組織的炎癥水平NO采用Griess法測定[9]。

小鼠肝組織SOD及GSH-Px活性測定:取10%的小鼠肝組織0．9%氯化鈉注射液勻漿液，在4℃，12 000 r/min離心15 min，取上清液，稀釋成1%肝組織勻漿，根據試劑盒說明書測定肝組織蛋白水平、SOD及GSH-Px活性。

小鼠肝組織皮質酮激素受體(GR)mRNA表達測定:取肝臟組織，用Trizol提取總RNA，逆轉錄反應以總RNA 3 μg為模板，總反應體系20 μL，42℃水浴1 h合成cDNA。PCR反應條件設置，94℃預變性 5 min，94℃變性 30 s，60℃退火40 s，72℃延伸 50 s，72℃再延伸7 min。重復b，c，d 3步30個循環，同法以18S mRNA為內參進行PCR擴增。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，Bio-rad凝膠成像系統記錄結果，Quantity One軟件進行灰度分析。結果以GR與內參照物18S mRNA擴增片段灰度值的比值(relative intensity)表示GR mRNA相對水平。PCR反應結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳，用Bio-Rad凝膠成像系統記錄結果，并以Quantity One軟件進行灰度分析。

1．3 統計學處理

采用 SPSS 13．0軟件，利用 ANOVA檢驗和 Dunnett's檢驗進行統計學處理，實驗數據以(X ±s)表示，P ＜0．05有統計學意義。

2 結果

2．1 對小鼠血漿ALT和AST水平的影響

結果見圖1。ALT和AST是反映肝臟炎癥程度的重要指標。拘束應激負荷后，小鼠血漿ALT水平顯著上升，表明應激誘發肝炎。與模型組(M組)相比，陽性藥、四逆散高中劑量均能顯著降低應激負荷小鼠血漿ALT和AST水平(P＜0．05)。

圖1 四逆散對拘束應激負荷小鼠血漿ALT和AST水平的影響

2．2 對小鼠血漿CORT水平及肝臟GR表達的影響

結果見圖2和圖3。CORT是糖皮質激素的一種，與受體GR結合后調節應激反應。拘束應激負荷后，小鼠血漿CORT水平顯著升高;與M組相比，陽性藥及四逆散高中劑量均能顯著降低應激負荷小鼠血漿CORT水平(P＜0．05)。GR mRNA表達的強弱可間接反映機體皮質激素的響應水平。拘束應激負荷后，小鼠GR mRNA表達顯著下調;與M組相比，陽性藥及四逆散高中劑量對應激負荷小鼠的GR mRNA表達并無顯著影響(P＞0．05)。

圖2 四逆散對拘束應激負荷小鼠血漿CORT水平的影響

圖3 四逆散對拘束應激負荷小鼠GR mRNA表達的影響

2．3 對小鼠肝組織抗氧化能力指數的影響

結果見圖4和圖5。拘束應激負荷后，小鼠肝組織ORAC值顯著降低;與M組相比，陽性藥及四逆高中劑量均能顯著升高應激負荷小鼠肝組織ORAC值(P＜0．05)。

圖4 肝組織ORAC指數測定示意圖

圖5 四逆散對拘束應激負荷小鼠肝組織ORAC的影響

2．4 對小鼠肝組織MDA水平的影響

結果見圖6。MDA是衡量機體內脂質過氧化程度的一個重要指標，間接反映了細胞的損傷程度。拘束應激負荷后，小鼠肝組織MDA水平顯著上升，表明應激對小鼠肝組織造成損傷。與M組相比，陽性藥及四逆散高中劑量均能顯著降低應激負荷小鼠肝組織MDA 水平(P ＜0．05)。

2．5 對小鼠肝組織NO水平的影響

結果見圖7。NO大量生成被認為是細胞損傷一個重要原因，阻止其釋放是作為阻止炎癥損傷重要方法之一。拘束應激負荷后，小鼠肝組織NO水平顯著升高，表明拘束應激誘發了肝損傷。與M組對比，陽性藥及四逆散高中劑量均能顯著降低應激負荷小鼠肝組織NO水平(P＜0．05)。

圖6 四逆散對拘束應激負荷小鼠肝組織MDA水平的影響

圖7 四逆散對拘束應激負荷小鼠肝組織NO水平的影響

2．6 對小鼠肝組織SOD與GSH-Px活性的影響

圖8 四逆散對拘束應激負荷小鼠肝組織SOD活性的影響

圖9 四逆散對拘束應激負荷小鼠肝組織GSH-Px活性的影響

3 討論

拘束應激使動物產生的綜合應激反應接近人的心理應激，該模型與中醫七情學說在認識上存在著共同點，可以用應激模型來模仿人類情志致病[10]。本研究結果表明，小鼠拘束負荷18 h后血漿ALT和AST活性顯著上升，表明拘束應激負荷造成肝臟損傷。與模型組相比，四逆散高中劑量均能顯著降低應激負荷小鼠血漿ALT和AST水平，表明四逆散對應激負荷造成的肝損傷有保護作用。在應激下，機體為了防止炎癥反應過激，在啟動全身炎癥反應的同時也啟動內部的抗炎效應，其中重要的表現之一就是釋放大量的皮質激素以激活GR發揮抗炎功能[11]。本研究發現，與空白對照組對比，拘束應激負荷小鼠血漿CORT水平顯著上升，而GR mRNA表達下調。提示在拘束應激負荷下，CORT與GR結合減少，甚至可能出現CORT抵抗，其抗炎作用得不到正常的發揮。四逆散給藥后，拘束應激負荷小鼠血漿CORT水平明顯下降，而GR mRNA表達并沒有顯著性變化，這表明四逆散能降低血漿游離CORT水平，但不具有激活GR表達的藥效。四逆散可能主要是通過降低血漿CORT水平，使激素抵抗效應減輕或消除而發揮對拘束應激負荷小鼠的保肝作用。

此外，CORT與GR結合，能激活細胞內PKA、P38絲裂素活化蛋白激酶途徑信息調控路徑，提高iNOS的表達量，從而造成細膜及線粒體DNA(mtDNA)等生理功能[14]，會造成內源性活性氧(ROS)的大量產生。本研究結果也表明，拘束應激負荷能造成小鼠肝臟NO水平大量上升。本研究進一步以生物膜中不飽和脂肪酸脂質過氧化反應的最終產物MDA水平來反映機體過氧化狀態，以ORAC值反映機體清除氧自由基的能力，進而評價機體的氧化與抗氧化平衡。結果發現，與空白對照組相比，拘束應激負荷小鼠肝組織MDA水平顯著升高，而ORAC值明顯降低，說明拘束應激負荷對小鼠肝組織細胞膜造成損傷，使小鼠機體肝細胞處于一種氧化損傷狀態。與模型組相比，四逆散能顯著改善因拘束應激引起的MDA和ORAC變化，緩和機體的過氧化狀態。進一步的研究結果顯示，拘束應激負荷顯著降低小鼠肝組織的SOD和GSH-Px活性，表明拘束應激負荷對肝組織的抗氧化系統有破壞作用，導致小鼠清除自由基的能力下降。四逆散給藥后，拘束應激負荷小鼠SOD及GSH-Px活性明顯升高，表明四逆散能增強應激狀態下小鼠的抗氧化能力，恢復小鼠機體的氧化與抗氧化平衡。

總之，四逆散的疏肝解郁作用可能與緩解應激負荷引起的肝損傷有關，其保護機制與抑制應激負荷引起的炎癥發生以及氧化損傷作用有關。

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