高效液相色譜法測定大鼠血漿中咪達唑侖含量＊

劉宏達，張志清，任靜華，何文娟

(1．河北省滄州市人民醫院，河北 滄州 061000;2．河北醫科大學第二醫院，河北 石家莊 050000)

咪達唑侖又稱速眠安，屬苯二氮 類鎮靜催眠藥。咪達唑侖為親脂性物質，能直接抑制腦干網狀結構上行激活系統，具有強大的鎮靜催眠作用，臨床廣泛用于抑郁癥、焦慮等疾病。其在pH＜4的酸性溶液中形成穩定的水溶性鹽，臨床制劑為鹽酸鹽或馬來酸鹽。咪達唑侖主要在肝臟經肝微粒體酶CYP3A4氧化，因此經常將此藥作為探針藥物[1-2]研究其藥代動力學變化。目前已報道的咪達唑侖血藥濃度測定方法，流動相制備復雜，血漿樣品處理操作煩瑣、成本高。本研究中建立了檢測大鼠血漿中咪達唑侖質量濃度的高效液相色譜法，方法簡便、準確、靈敏度高，可為咪達唑侖大鼠體內的藥動學研究提供方法學參考。

1 儀器、試藥與動物

高效液相色譜系統，包括515泵、486紫外檢測器、Empower Application操作平臺(美國Waters公司);GL-20G-Ⅱ型冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠);XW-80A型渦旋混合器(上海醫科大學儀器廠)。咪達唑侖對照品(宜昌人福藥業責任有限公司，批號為MD111106，含量100．8%);咪達唑侖注射液(江蘇恩華藥業集團有限公司，批號20110825，規格為5 mL∶5 mg);乙腈(色譜純，天津市康科德科技有限公司，批號為111203)。健康SD大鼠，清潔級，雄性，體重(300±10)g，由山西省動物實驗中心提供，動物許可證號為SCXK(晉)2009-0001。

2 方法與結果

2．1 色譜條件

色譜柱:Diamonsil C18柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm);流動相:乙腈 -水(62 ∶38，V/V);流速:1．0 mL/min;檢測波長:225 nm;柱溫:30 ℃;進樣量:20 μL。

2．2 血漿樣品處理

冷凍血漿樣品室溫自然解凍，10 000 r/min離心5 min，取上層 200 μL 于離心管中，加內標(150 μg/mL 地西泮溶液)20 μL，混勻后，加提取劑500 μL(異丙醇 ∶乙酸乙酯=2∶8)，渦旋震蕩1 min，10 000 r離心處理 5 min，取上清液 500 μL，于 37 ℃水浴，氮氣流吹干，100 μL甲醇復溶，進樣。

2．3 專屬性試驗

取咪達唑侖對照品溶液直接進樣，另取空白血漿、空白血漿加咪達唑侖對照品及給藥后2 h的血漿樣品，分別按2．2項下方法處理并測定，記錄色譜圖。結果表明，在該色譜條件下，咪達唑侖和內標物峰形良好，保留時間分別為6．7 min和8．2 min，大鼠血漿中內源性物質對咪達唑侖的測定無干擾。見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2．4 標準曲線繪制

取空白血漿，制備質量濃度分別為 0．1，0．25，1，5，10，20，30 μg/mL的咪達唑侖模擬血漿樣品，按2．2項下方法處理并測定。以咪達唑侖與內標的峰面積比值(Y)為縱坐標，血漿藥物質量濃度(X)為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程為 Y=0．075 2 X-0．004 2，r=0．999 9(n=7)。結果表明，咪達唑侖質量濃度在0．1～30 mg/L范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2．5 回收率試驗

咪達唑侖及內標提取回收率:取空白血漿15份，分為3組，分別制備0．25，5，20 mg/L的咪達唑侖模擬血漿樣品，按照2．2血漿樣品處理、測定，記錄峰面積。咪達唑侖峰面積與等量咪達唑侖對照品溶液直接進樣的峰面積比值，即咪達唑侖的提取回收率在85% ～91%之間，符合要求，RSD值也均在規定范圍內，結果見表1。

表1 大鼠體內血漿中咪達唑侖提取回收率和方法回收率試驗結果

方法回收率:取空白血漿15份，分為3組，分別制備0．25，5，20 mg/L的咪達唑侖模擬血漿樣品，按照2．2血漿樣品處理、測定，記錄峰面積。按照標準曲線方程計算測得濃度與加入的理論濃度的比值即方法回收率。結果表明，低、中、高3種質量濃度的方法回收率分別為(109．8±4．54)% ，(101．6±3．28)% 和(104．9 ±4．23)%，符合要求，結果見表 1。

2．6 精密度試驗

取空白血漿15份，分為3組，每組5份，分別制備0．25，5，20 mg/L的咪達唑侖模擬血漿樣品，按照2．2血漿樣品處理方法處理，分別于1日內不同時間處理并測定，計算日內精密度;于0，1，2，3，4 d處理并測定，計算日間精密度。3種質量濃度模擬血漿樣品的日內精密度和日間精密度的 RSD值均符合要求，該方法精密度良好，結果見表2。

表2 日內和日間精密度(n=5)

3 討論

在藥學的一般試驗中，常規選擇200～250 g的健康大鼠，而本研究因為咪達唑侖藥物用量小，僅10 mg/kg給藥量，對大鼠尾靜脈注射的準確性要求高，故選用了300 g左右的健康成年大鼠，目的是為減少操作失誤，保障注射劑量的準確性。

近年來臨床上在鎮靜、抗驚厥的治療中常選擇咪達唑侖持續靜脈滴注，此途徑可使咪達唑侖濃度維持在一個穩定的范圍，但長時間靜脈滴注可使其血漿半衰期顯著延長。在使用高劑量咪達唑侖作誘導麻醉時，藥效學方面存在較大的個體差異[3-4]。因此，研究血漿中咪達唑侖濃度測定方法具有十分重要的意義。關于血漿咪達唑侖濃度測定已有文獻報道[5-7]，本試驗從臨床藥物檢測角度建立了高效液相色譜法測定咪達唑侖在大鼠體內的分布濃度，通過對大鼠體內不同劑量給藥和檢測給藥后不同時間藥物的分布情況，取得了大量科學數據，為該藥的研究建立了簡便、準確的科學分析方法。

[1]夏 軍，謝文明，樊寶才，等．HPLC法同時測定大鼠血漿中氯唑沙宗和咪達唑侖的濃度[J]．藥學與臨床研究，2012，20(2):172-174．

[2]朱學慧，婁建石．細胞色素P4503A選擇性探針藥物的評價[J]．中國臨床藥理學與治療學，2004，9(4):365-369．

[3]國家食品藥品監督管理局藥品評審中心．MCDEX藥物臨床信息參考[M]．成都:四川科學技術出版社，2004:268．

[4]劉錫勻．實用藥物指南[M]．北京:人民軍醫出版，2000:123．

[5]陸曉彤，蔣樾廉，張順國．固相萃取-HPLC法測定兒童血漿中咪達侖的濃度[J]．中國藥房，2007，18(17):1 326-1 328．

[6]田志松．高效液相色譜法同時測定人血漿1'-羥基咪達唑侖與咪達唑侖的含量[J]．醫藥導報，2006，25(5):404-405．

[7]胡利華，許 麗，王曉玲，等．HPLC法測定人血漿中咪達唑侖含量[J]．中國醫院用藥評價與分析，2009(7):522-523．