清熱安宮丸等中成藥微生物限度檢查方法驗證

黃 英

(云南省麗江市食品藥品檢驗所，云南 麗江 674100)

根據2010年版《中國藥典(一部)》規(guī)定，在進行藥品微生物限度檢查時，應對所用方法進行驗證，以確認所采用的方法適合于該藥品的微生物限度檢查[1]。有些中成藥含有較強的抑菌成分，由于抑菌成分的干擾，采用常規(guī)法進行微生物限度檢查，其結果不能真實反映其污染的微生物狀況。為使檢測結果科學、準確，檢測前應進行方法學驗證。筆者對清熱安宮丸等中成藥進行了方法學驗證試驗，現(xiàn)報道如下。

1 試驗材料

1．1 菌種

枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]，均由云南省食品藥品檢驗所提供。

1．2 培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂、玫瑰紅鈉瓊脂、營養(yǎng)肉湯、改良馬丁、改良馬丁瓊脂，MUG、麥康凱瓊脂、膽鹽乳糖、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基為北京三藥科技開發(fā)公司和北京牛牛基因技術有限公司產品，按規(guī)定進行培養(yǎng)基的適用性檢查均為合格。稀釋劑為pH=7．0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液。

1．3 樣品

婦康寧片(江西華太藥業(yè)有限公司，0．25 g/片)，復方川貝精片(廣東一力集團制藥有限公司，100片/瓶)，歸脾丸(云南省騰沖制藥廠，9 g/丸)，舒肝益脾顆粒(重慶陪都藥業(yè)股份有限公司，10 g/袋)，補腎寧片(山東希力藥業(yè)有限公司，0．2 g/片)，荊防顆粒(昆明中藥廠有限公司，15 g/袋)，抗宮炎膠囊(江西心正藥業(yè)有限責任公司，0．5 g/粒)，寧心安神膠囊(西安方興制藥有限公司，0．5 g/粒)，抗病毒片(天津金世制藥有限公司，0．32 g/片)，消咳喘片(哈藥集團三精黑河藥業(yè)有限公司，0．3 g/片)，藿香正氣滴丸(天津天士力制藥股份有限公司，2．6 g/袋)，消栓顆粒(黑龍江省濟仁藥業(yè)有限公司，4 g/袋)，清熱安宮丸(江西國藥有限責任公司，3．5 g/丸)。

2 方法與結果[1]

2．1 菌液制備

取經30～35℃培養(yǎng)18～24 h的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物1 mL，用0．9%無菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋至10-7～10-5，使成50～100 cfu/mL，經活菌計數后備用。

取經23～28℃ 培養(yǎng)24～48 h的白色念珠菌的改良馬丁液體培養(yǎng)物1 mL，用0．9%無菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋至10-6～10-5，使成50～100 cfu/mL，經活菌計數后備用。

取經23～28℃培養(yǎng)1周的黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物，用5 mL含0．05%聚山梨酯80的0．9%無菌氯化鈉溶液洗下黑曲霉孢子，吸出孢子懸液1 mL至無菌試管內，用含0．05%聚山梨酯80的0．9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含孢子數50～100 cfu的孢子懸液。

2．2 供試液制備

稱取樣品10 g，加pH=7．0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，制成1∶10均勻的供試液。

2．3 細菌、霉菌及酵母菌計數方法驗證試驗

2．3．1 平皿菌落計數法(常規(guī)法)

取1∶10供試液1 mL入皿，然后每皿加營養(yǎng)瓊脂或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基15～20 mL，搖勻，按2010年版《中國藥典(一部)》附錄微生物限度檢驗方法進行，計算3次試驗的平均回收率。結果見表1。結果表明，婦康寧片、復方川貝精片、歸脾丸、舒肝益脾顆粒、補腎寧片、荊防顆粒6個品種對5株試驗菌無抑菌作用，回收率均高于70%，可用常規(guī)法檢查。其他品種對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有不同程度的抑菌作用，需改用培養(yǎng)基稀釋法或離心薄膜過濾法重新驗證。另外，各品種對大腸埃希菌、白色念珠菌及黑曲霉無抑菌作用，回收率均高于70%，因此霉菌和酵母菌數計數，均可用常規(guī)法檢查。

2．3．2 培養(yǎng)基稀釋法

取1∶10供試液1 mL，注入5個平皿中(每平皿0．2 mL)，然后每皿加營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15～20 mL，搖勻，按2010年版《中國藥典(一部)》附錄微生物限度檢驗方法進行，計算3次試驗的平均回收率。結果見表2。可見，抗宮炎膠囊、寧心安神膠囊、抗病毒片、消咳喘片4個品種采用培養(yǎng)基稀釋法(0．2 mL/皿)法，對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌回收率均大于70%。

表1 清熱安宮丸等中成藥常規(guī)法(1 mL/皿)各試驗菌回收率(%)

表2 培養(yǎng)基稀釋法(0．2mL/皿)和離心沉淀法＋薄膜過濾法回收率(%)

2．3．3 離心沉淀法＋薄膜過濾法

取1∶10供試液10 mL，移至滅菌離心管中，用500 r/min離心3 min，取上層液1 mL加入100 mL稀釋液(pH=7．0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液)中，經減壓抽濾干凈后，用pH=7．0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，每次約100 mL，共沖洗400 mL/膜，在最后一次沖洗液中加入菌懸液1 mL(50～100 cfu/mL)。濾干后取膜，菌面向上貼于營養(yǎng)瓊脂平板，經35℃培養(yǎng)3 d后，點計菌落數。計算3次試驗的平均回收率，結果見表2。可見，藿香正氣滴丸、消栓顆粒、清熱安宮丸3個品種采用離心薄膜過濾法，對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌回收率均大于70%。

2．4 控制菌檢查驗證試驗

試驗組:取規(guī)定量供試液及10～100 cfu試驗菌株，加入相應規(guī)定量的培養(yǎng)基中，按各控制菌檢查法檢查。

樣品組:取規(guī)定量供試液，加入相應規(guī)定量的培養(yǎng)基中，按各控制菌檢查法檢查。

控制菌檢查結果:試驗組檢出試驗菌，樣品組未檢出控制菌。各必檢控制菌均可用常規(guī)法檢查。

3 討論

中成藥中往往含有多種具有抑菌活性的中藥材，其抑菌作用是幾種藥材抑菌作用的共同體現(xiàn)。寧心安神膠囊處方中含有抑菌成分(丹參、黃連)、抗病毒片處方中含有抑菌成分(連翹、廣藿香)、消栓顆粒處方中含有抑菌成分(黃芪)、清熱安宮丸處方中含有多種抑菌成分(大黃、黃芩、黃柏、梔子、黃連、冰片)等。據文獻報道[2-4]，上述處方中的黃芩、黃柏、黃連、梔子、連翹、冰片、黃芪、丹參、大黃等多味中藥均對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等有抗菌作用，所以對5株代表菌中的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌較敏感，說明抑菌作用的強弱，與處方中所含的抑菌成分的種類、數量及處方中藥物間的相互作用有關。由于抑菌成分的影響，可能阻止某些敏感細菌的生長繁殖，不能真實地反映藥品污染菌的程度。因此需要針對每個品種進行方法驗證以確定檢驗方法的可行性，根據藥品抑菌作用的強弱，選擇合適的方法進行微生物限度檢查。

[1]國家藥典委員會．中華人民共和國藥典(一部)[M]．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄79-附錄88．

[2]特玉香，劉 鵬，戴 翠，等．黃連上清丸微生物限度檢查方法驗證淺析[J]．藥物分析雜志，2006，26(11):1 674-1 677．

[3]宋 勤，杜平華．中成藥微生物限度檢查方法的探討[J]．中國藥事，2006，20(1):46-47．

[4]于風平，楊美琴，特玉香，等．含大黃、黃芩、黃連和黃柏藥材的中成藥微生物限度檢查法的建立[J]．藥物分析雜志，2010，30(3):558-562．