CXCR4和VEGF-C在胃癌淋巴結轉移中的作用及相關性

李利義 徐斌 羅越 韓紹偉 金洲祥 鄭志強

CXCR4和VEGF-C在胃癌淋巴結轉移中的作用及相關性

李利義 徐斌 羅越 韓紹偉 金洲祥 鄭志強

目的 探討CXCR4和VEGF-C在胃癌淋巴結轉移中的作用及兩者的相關性。 方法 應用免疫組化法及RT-PCR檢測CXCR4及VEGF-C在人胃癌組織中的表達水平，并分析其與胃癌淋巴結轉移的關系。結果 CXCR4及VEGF-C蛋白在癌旁組織中無陽性表達，在胃癌組織中均呈陽性表達。胃癌組織中CXCR4及VEGF-C蛋白陽性表達率均明顯高于癌旁組織（P＜0.05或0.01），且N0組織、N1+N2組織、N3組織中CXCR4及VEGF-C蛋白陽性表達率兩兩比較差異均有統計學意義（P＜0.05或0.01）。不同胃癌組織中CXCR4mRNA及VEGF-CmRNA的表達明顯不同，差異均有統計學意義（P＜0.05或0.01）。胃癌組織中CXCR4表達與VEGF-C表達呈顯著正相關（r=0.355，P＜0.01）。 結論 胃癌中CXCR4和VEGF-C的表達呈正相關，兩者的協同作用與胃癌患者淋巴結轉移密切相關，進一步研究兩者的作用機制可能對預測淋巴結轉移及判斷預后有重要臨床價值。

CXCR4 血管內皮生長因子-C 胃癌 淋巴轉移

胃癌在世界范圍內的發病率居惡性腫瘤第二位，占消化道惡性腫瘤的首位。復發和轉移是胃癌死亡的最主要原因，其中淋巴結轉移是其最常見的轉移方式，有研究表明淋巴結轉移是胃癌患者預后的獨立危險因素[1]。趨化因子CXCR4及其配體CXCLl2所構成的信號傳導通路參與調控細胞內肌動蛋白聚合、骨架重排、偽足形成、細胞運動，與腫瘤器官特異性轉移密切相關[2]。血管內皮生長因子-C（VEGF-C）因其可通過激活淋巴管內皮細胞上的受體VEGFR-3，從而促進淋巴管內皮細胞增殖分化并誘導淋巴管生成，進而促進胃癌淋巴結轉移，是目前臨床研究的熱點。本研究應用免疫組化及RT-PCR方法檢測CXCR4和VEGF-C在人胃癌組織中的表達情況，旨在探討CXCR4與VEGF-C在胃癌淋巴結轉移中的作用及兩者的相關性。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2009-12—2010-12在溫州醫學院附屬第二醫院外科行手術治療的胃癌患者76例，其中男52例，女24例，年齡26～79（57.0±1.8）歲。所有患者術前均經病理學證實，均未接受放療或化療[3]。按照日本胃癌協會（JGCA）2010年分期標準分期，淋巴結轉移情況為：N0者30例，N1者9例，N2者26例，N3者11例。每份標本均于術后10min內取材于腫瘤組織及正常胃黏膜組織（距腫瘤組織邊緣＞5cm，作為正常對照），全部標本取材后迅速分成兩份，分別置于10%甲醛溶液中固定和-80℃冰箱保存備用。

1.2 主要試劑 兔抗人VEGF-C試劑盒為北京中山生物技術有限公司產品，鼠抗人CXCR4抗體購自美國Sigma公司，免疫組化S-P試劑盒購自德國寶靈曼公司。CXCR4、VEGF-C引物由北京奧科生物技術公司設計。總RNA提取試劑盒和逆轉錄試劑盒購于美國Gibico BRL公司。

1.3 方法

1.3.1 CXCR4和VEGF-C蛋白表達的檢測 采用鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化酶染色法。石蠟切片脫蠟，以微波枸櫞酸鹽進行抗原修復，DAB顯色，蘇木精復染，脫水，透明封片，顯微鏡下觀察，用已知的陽性切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。結果判定：在組織切片中CXCR4和VEGF-C陽性細胞主要表現為細胞質、細胞膜染為棕黃色。判定標準：采用雙盲法計數10個高倍視野，陽性細胞數＜10%為陰性，≥10%為陽性，同時忽略較弱或可疑的染色。

1.3.2 CXCR4 mRNA和VEGF-C mRNA表達的檢測 胃癌標本從-80℃冰箱內取出后，迅速置于研缽中，在液氮中研磨為粉末狀，然后按試劑盒操作說明提取總RNA。取2μg總RNA，依照試劑盒說明逆轉錄合成cDNA后行PCR擴增，以3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內對照。擴增引物為：CXCR4前向引物5′-AAGAAACTGAGAAGCATGACC-3′，后向引物5′-GAAACTGGAACACAACCACC-3′，擴增片段大小為293bp。VEGF-C前向引物5′-AATGTGGGGCCAACCGAGAA-3′，后向引物5′-CCAATATGAAGGGACACAACG-3′，擴增片段大小為285bp。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統成像，計算條帶的光密度值。結果判定：以同一模板CXCR4或VEGF-C與GAPDH的條帶灰度的比值作為CXCR4或VEGF-C的表達指數。

1.4 統計學處理 采用SPSS16.0統計軟件，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗；組間率的比較采用χ2檢驗；相關性檢驗采用Spearman等級相關分析。

2 結果

2.1 CXCR4及VEGF-C蛋白在胃癌組織及癌旁組織中的表達情況比較 見表1。

由表1可見，CXCR4及VEGF-C蛋白在癌旁組織中無陽性表達，在胃癌組織中均呈陽性表達（圖1-2）。胃癌組織中CXCR4及VEGF-C蛋白陽性表達率均明顯高于癌旁組織（P＜0.05或0.01），且N0組織、N1+N2組織、N3組織中CXCR4及VEGF-C蛋白陽性表達率兩兩比較差異均有統計學意義（P＜0.05或0.01）。

表1 CXCR4及VEGF-C蛋白在胃癌組織及癌旁組織中的表達情況比較（例）

圖1 胃癌組織中CXCR4陽性表達（DAB顯色，×400）

圖2 胃癌組織中VEGF陽性表達（DAB顯色，×400）

2.2CXCR4mRNA及VEGF-CmRNA在胃癌組織中的表達情況比較 見圖3、表2。

圖3 不同胃癌組織中CXCR4mRNAVEGF-CmRNA的表達情況

由圖3及表2可見，不同胃癌組織中CXCR4mRNA及VEGF-CmRNA的表達明顯不同，差異均有統計學意義（P＜0.05或0.01）。

2.3 胃癌組織中CXCR4與VEGF-C表達的相關性 見表3。

由表3可見，胃癌組織中CXCR4表達與VEGF-C表達呈顯著正相關（r=0.355，P＜0.01）。

表2 不同胃癌組織中CXCR4mRNA及VEGF-CmRNA的表達指數

表3 胃癌組織中CXCR4與VEGF-C表達的相關性（例）

3 討論

淋巴結轉移是胃癌主要的轉移途徑，也是胃癌患者預后的獨立危險因素。因此，研究淋巴結轉移的分子機制，控制淋巴結的轉移，已成為臨床治療胃癌的重要環節，也為治療胃癌的藥物研究提供了新的靶點。

趨化因子CXCL12與其特異性受體CXCR4所構成的CXCL12-CXCR4生物學軸在多種腫瘤的播散和器官特異性轉移中發揮著重要作用。CXCR4是神經纖毛蛋白-1（Neuropilin-1，NRP-1）的下游分子，是一個編碼352個氨基酸且高度保守的G蛋白偶聯七次跨膜受體。惡性腫瘤細胞高表達趨化因子受體CXCR4，并可能在CXCL12趨化、牽引下致使腫瘤細胞轉移至作為配體產生源的某些器官（如肺、骨、肝、腎、淋巴結等），從而形成器官特異性的轉移[4-6]。

Muller等[7]首次報道人乳腺癌細胞系和乳腺癌組織中高表達趨化因子受體CXCR4，而在乳腺癌最常見的轉移部位如淋巴結、肺、肝臟和骨髓則高表達其配體CXCL12，提示趨化因子及其受體的同步高表達在決定乳腺癌器官特異性轉移的過程中起著非常關鍵的作用。Yasumoto等[8]采用免疫組化方法檢測胃癌組織中CXCR4的表達，結果顯示伴有腹膜轉移的胃癌組織中CXCR4的陽性率為67%，顯著高于無腹膜轉移者的25%。蘇一樂等[9]的研究證明，CXCR4在子宮頸癌向盆腔淋巴結組織轉移中起重要作用。本研究結果顯示，CXCR4在癌旁正常胃組織中無陽性表達，顯著低于N0組胃癌組織中的表達率；N1+N2組織中CXCR4陽性表達率明顯高于N0組織；且N0及N1+N2組織中CXCR4陽性表達率均明顯低于N3組織；同時還發現，隨著胃癌淋巴結轉移的增加，CXCR4 mRNA表達明顯上調。以上結果提示CXCR4的表達可能促進胃癌的淋巴結轉移，其可能機制為胃癌組織高表達CXCR4與淋巴結選擇性高表達其特異性配體CXCL12，從而促進胃癌的淋巴轉移。

VEGF-C是新生血管形成的重要調控因子，可以通過與淋巴管內皮細胞上的VEGF受體結合，增加淋巴管的通透性，促進淋巴細胞的增生，誘導淋巴管的生成[10]。本文結果顯示，VEGF-C在癌旁正常胃組織中陽性表達率為9.21%，顯著低于N0組織中的陽性表達率（40%）；N1+N2組織中CXCR4陽性表達率明顯高于N0組織；且N0及N1+N2組織中CXCR4陽性表達率均明顯低于N3組織；另外，隨著胃癌淋巴結轉移的增加，VEGF-C mRNA表達明顯上調。以上結果提示VEGF-C可能與胃癌的發生、發展有關，與有無淋巴結轉移密切相關，其表達水平的增高可能促進腫瘤淋巴管的生成及淋巴結的轉移。

此外，本研究結果還顯示，CXCR4和VEGF-C的表達呈正相關，說明兩者在胃癌的發展中存在協同作用。有淋巴轉移的46例胃癌標本中有34例表達CXCR4，有36例表達VEGF-C；在33例共同表達CXCR4和VEGF-C的胃癌標本中有28例存在淋巴結轉移。這些證據表明CXCR4、VEGF-C與胃癌淋巴結轉移密切相關。Tao等[11]發現，VEGF-C和NRP-1結合可以增強腫瘤的存活能力和侵襲活性。因此筆者認為，VEGF-C可能通過某種機制調節CXCR4的產生或表達，形成VEGF-C-NRP-1-CXCR4信號通路，協同促進胃癌淋巴結轉移。進一步研究CXCR4和VEGF-C在胃癌淋巴轉移中的作用機制，可能為評估胃癌的淋巴結轉移情況提供新的生物學指標，亦可能為胃癌淋巴結轉移找到新的治療途徑。

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Association of CXCR4 and VEGF-C with lymphatic metastasis in gastric cancer

LI Liyi,XU Bin,LUO Yue,et al.
Department of General Surgery,The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College,Whenzhou 325027,China

Objective To investigate the association of CXCR4 and VEGF-C with lymphatic metastasis in gastric cancer. Methods The expressions of CXCR4 and VEGF-C proteins and mRNAs in human gastric cancer were detected by immunohistochemistry and RT-PCR,respectively.The relationship between CXCR4 and VEGF-C expressions and lymph node metastasis of gastric cancer was analyzed. Results CXCR4 and VEGF-C proteins were positively expressed in gastric cancer tissue,while they were not detected in pericancerous gastric tissue.The positive rate of CXCR4 and VEGF-C protein expression in gastric cancer tissue was significantly higher than that in pericancerous gastric tissue(P＜0.05 or 0.01).There were significant differences in positive expression rates of CXCR4 and VEGF-C proteins and mRNAs among stage N0,N1+N2and N3gastric cancers(P＜0.05或0.01).The expression level of CXCR4 was positively correlated with that of VEGF-C(r=0.355,P＜0.01). Conclusion The synergy of CXCR4 and VEGF-C was closely related to the lymphatic metastasis of gastric cancer,and further study on the mechanism may has important clinical value in predicting lymph node metastasis and prognosis.

CXCR4 VEGF-C Gastric cancer Lymphatic metastasis

2013-04-01）

（本文編輯：歐陽卿）

溫州市科技計劃基金資助項目（Y20090061）；溫州市甌海區科技計劃項目（20090137）

325027 溫州醫學院附屬第二醫院普外科（李利義、羅越、韓紹偉、金洲祥、鄭志強）；溫州市甌海區人民醫院普外科（徐斌）