食管鱗癌患者血清蛋白質(zhì)譜分析及其與預(yù)后的關(guān)系

江洪 王小紅 鄭智國(guó) 趙強(qiáng)

●論 著

食管鱗癌患者血清蛋白質(zhì)譜分析及其與預(yù)后的關(guān)系

江洪 王小紅 鄭智國(guó) 趙強(qiáng)

目的 用表面增強(qiáng)激光解析離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜（SELDI-TOF-MS）儀檢測(cè)食管鱗癌患者血清蛋白表達(dá)水平的差異，并分析其與患者預(yù)后的關(guān)系。 方法 用SELDI-TOF-MS儀和弱陽(yáng)離子納米磁珠檢測(cè)144例初診食管癌患者和50例健康人的血清蛋白，進(jìn)行比較，并對(duì)所有患者進(jìn)行隨訪，分析患者血清蛋白的差異與預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果 144例初診食管癌患者和50例健康人的血清蛋白比較，在分子量1 500～30 000范圍內(nèi)，共檢測(cè)到93個(gè)蛋白峰，其中10個(gè)差異峰有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；92例存活期2年以上患者與52例存活期2年以下患者比較，蛋白峰的差異值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ⅱ期患者中存活期2年以上與存活期2年以下的患者比較，有2個(gè)蛋白峰的差異值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Ⅲ期患者中存活期2年以上與存活期2年以下的比較，有1個(gè)蛋白峰的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論 食管鱗癌患者血清蛋白質(zhì)譜的差異與患者的預(yù)后有一定關(guān)系，蛋白指紋圖譜檢測(cè)結(jié)果對(duì)臨床治療有指導(dǎo)意義。

食管癌 蛋白指紋圖譜 預(yù)后

食管鱗狀上皮癌是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤，多數(shù)患者就診時(shí)已屬中晚期，缺少能夠早期診斷和預(yù)測(cè)患者預(yù)后的特異性標(biāo)志物。因此尋找高效的分子標(biāo)志物對(duì)食管癌的診治具有重要意義。我們用表面增強(qiáng)激光解析離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（surface-enhanced laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry,SELDI-TOF-MS）及弱陽(yáng)離子納米磁珠，檢測(cè)初診食管癌患者的血清蛋白表達(dá)的改變，同時(shí)對(duì)所有患者進(jìn)行隨訪，分析患者血清蛋白的差異與預(yù)后的關(guān)系，為臨床治療提供依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料 采集2007年8月至2010年6月浙江省腫瘤醫(yī)院初診的144例食管鱗癌患者術(shù)前外周血,年齡43～75歲，中位年齡60歲。另取50例性別、年齡匹配的健康志愿者外周血（年齡36～78歲，中位年齡56歲）作為對(duì)照。144例初診食管癌患者均經(jīng)胃鏡病理檢查證實(shí)為食管鱗狀上皮癌，所有患者均排除肝炎、急性感染、合并其他惡性腫瘤等疾病,所有患者均行手術(shù)治療，手術(shù)方式為上腹-右胸兩切口或上腹-右胸-左頸三切口，術(shù)后病理檢查按UICC 2009版食管癌分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期（Ⅰ期28例，Ⅱ期59例，Ⅲ期51例，Ⅳ期6例）。1.2 儀器和試劑 乙腈、三氟乙酸、SPA（Sinapinicacid）、尿素、DTT、CHAPS、Tris-HCL、dH2O等購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。MALDI-TOF-MS（PBSⅡc）質(zhì)譜儀為美國(guó)Ciphergen Biosystems公司產(chǎn)品。弱陽(yáng)離子交換型（WCX）納米磁珠，結(jié)合緩沖液，洗脫液等為北京賽爾迪公司產(chǎn)品。患者治療前1天抽空腹外周靜脈血5ml。

1.3 方法

1.3.1 樣品收集與預(yù)處理 患者治療前外周血液采集后立即放入4℃冰箱靜置。1～2h內(nèi)，4℃4 000r/min離心5min分離血清后,4℃14 000r/min再離心5min，去除所有殘留細(xì)胞碎片。在冰上將血清轉(zhuǎn)移到新的離心管中,放入-80℃冰箱保存。使用前取出血清樣品，冰上融化。在標(biāo)記好的1.5ml離心管中依次加入20μl 9M緩沖液（9mol/L Urea，2%CHAPS，50mmol/L Tris-HCl，1%DTT，pH9.0），和10μl血清樣品，并將樣品混勻。稀釋好的樣品室溫靜置10min，然后再加入360μl結(jié)合緩沖液混勻。1.3.2 納米磁珠預(yù)處理、上樣和洗脫 將WCX納米磁珠分裝到PCR管，置于磁性處理器上，吸取液體。再依次加入100μl結(jié)合緩沖液,混勻后放置5 min，然后把PCR管置于磁性處理器上，吸取液體，重復(fù)上述操作1次。向每個(gè)裝有納米磁珠的PCR管中加入100μl稀釋好的血清樣品,混勻后室溫放置15min。將PCR管置于磁性處理器上，吸去未結(jié)合樣品。每管加入100μl結(jié)合緩沖液,混勻后放置5 min，然后把PCR管置于磁性處理器上，吸取液體，重復(fù)上述操作1次。然后，每管加入10μl洗脫液混勻，放置5min后置于磁性處理器上。取5μl上清液移到另一個(gè)PCR管中，加入5μl飽和SPA溶液充分混勻，吸取1μl點(diǎn)樣到Au芯片上，待干后放入儀器讀取。SPA飽和溶液為Sinapinic acid在50%乙腈（ACN）和0.5%三氟乙酸（TFA）的飽和溶液。

1.3.3 芯片檢測(cè)、數(shù)據(jù)采集和參數(shù)設(shè)置 采用PBSⅡc質(zhì)譜儀讀取芯片信息，用加有All-in-one標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的NP20芯片校正儀器，使分子量的誤差范圍＜0.1%。芯片閱讀儀參數(shù)設(shè)置如下：激光強(qiáng)度185,檢測(cè)靈敏度7，優(yōu)化范圍1 500～30 000，芯片上的每個(gè)點(diǎn)采集90次。用Ciphergen ProteinChip 3.2.1軟件收集數(shù)據(jù)。

1.4 隨訪 所有患者均采用電話隨訪，失訪4例，隨訪率為97.2%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件，統(tǒng)計(jì)患者生存期與蛋白峰值的關(guān)系。（1）用Biomarker Wizard軟件快速計(jì)算相同質(zhì)荷比（m/z）的蛋白質(zhì)在不同組間差異峰的P值。選擇信/噪比（S/N）＞5和在所有圖譜中出現(xiàn)頻率＞90%的峰作為有效蛋白峰。為避免遺漏小的蛋白峰，將S/N＞2和分子量偏差＜0.3%的峰也標(biāo)記為有效蛋白峰。然后，根據(jù)方差分析的原理計(jì)算不同組間相同質(zhì)荷比蛋白質(zhì)表達(dá)差異的P值（以Excel表輸出差異蛋白的分子量和相對(duì)強(qiáng)度）。

2 結(jié)果

33份食管鱗癌患者與33份對(duì)照者血清的原始蛋白指紋圖譜比較，在分子量1 500～30 000范圍內(nèi)共檢測(cè)到93個(gè)蛋白峰，其中10個(gè)在食管鱗癌組與對(duì)照組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），其中3 978，3 403兩個(gè)差異峰在食管癌患者和健康人群中變化情況見(jiàn)圖1。進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，食管癌患者144例，健康人群50例，采用SPSS 12.0中ROC曲線分析。10個(gè)差異峰ROC曲線分析結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 10個(gè)差異峰在144例食管癌和50例健康人群中ROC曲線下面積

由表1可見(jiàn)，其中2 768、2 745、3 403、6 638、5972、6 440、3 321和3 978m/z 8個(gè)差異峰ROC曲線下面積＞0.8，有比較好的診斷價(jià)值。

92例存活期2年以上患者與52例存活期2年以下患者比較，蛋白峰的差異值無(wú)統(tǒng)計(jì)意義。

Ⅱ期中45例存活期2年以上患者與14例存活期2年以下患者比較，有2個(gè)蛋白峰的差異值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

表2 Ⅱ期中45例存活期2年以上患者與14例存活期2年以下患者蛋白峰比較

Ⅲ期中22例存活期2年以上患者與29例存活期2年以下患者比較，有1個(gè)蛋白峰的差異值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3。

再將Ⅲ期中22例存活期2年以上患者與20例存活期1～2年患者比較，有1個(gè)蛋白峰的差異值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表4。

圖1 食管癌患者和健康對(duì)照者血清中2個(gè)差異蛋白峰（3 978和3 403）的原始質(zhì)譜圖（注：上4張圖譜為食管鱗癌患者，下4張圖譜為健康對(duì)照者；3 978m/z在食管癌患者中表達(dá)升高，3 403m/z在健康對(duì)照者中表達(dá)升高，在食管癌中未見(jiàn)表達(dá)升高）

表3 Ⅲ期中存活期2年以上與存活期2年以下蛋白峰比較

表4 Ⅲ期中存活期2年以上患者與存活期1～2年患者蛋白峰比較

3 討論

3.1 SELDI-TOF-MS技術(shù) 自從2002年日本學(xué)者田中一耕因發(fā)明蛋白指紋技術(shù)獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)之后,這項(xiàng)技術(shù)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步。美國(guó)國(guó)立癌癥研究所（NCI）所屬的早期疾病檢測(cè)研究網(wǎng)多中心Ⅲ期臨床試驗(yàn)得出結(jié)論：通過(guò)血清及儀器標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控，SELDI-TOF-MS技術(shù)是目前最有希望的腫瘤早期檢測(cè)方法。它的原理是利用高能激光束使芯片中的分析物解析形成離子，根據(jù)不同質(zhì)量電荷比（m/z）的離子在儀器場(chǎng)中飛行的時(shí)間也長(zhǎng)短不一，由此繪制出一張蛋白質(zhì)譜圖，經(jīng)電腦處理后，顯示樣品中各種蛋白質(zhì)分子量、含量等信息。

其主要優(yōu)點(diǎn)是：（1）組織來(lái)源廣泛，可直接用粗樣品進(jìn)行分析；（2）檢測(cè)樣品用量小，檢測(cè)快速；（3）檢測(cè)的敏感性和特異性高；（4）檢測(cè)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量范圍大，能發(fā)現(xiàn)低豐度、小分子量的蛋白質(zhì)；（5）應(yīng)用范圍廣，可用于腫瘤的病因、診斷、各種不同治療方法的療效監(jiān)測(cè)及患者預(yù)后評(píng)估等[1]。

但它在篩選蛋白標(biāo)記物及疾病早期診斷方面也存在一些缺陷。首先，多數(shù)實(shí)驗(yàn)僅限于發(fā)現(xiàn)一些差異蛋白質(zhì)峰和分子量，而在蛋白質(zhì)的序列、構(gòu)象、提純、特性等方面無(wú)法給出描述，從而不能進(jìn)一步鑒定出特定的蛋白質(zhì)。還有不同研究者對(duì)同一研究對(duì)象所得到的結(jié)果也不完全一致，其可重復(fù)性有待于進(jìn)一步提高。

3.2 食管癌患者血清蛋白水平與預(yù)后的關(guān)系 目前許多學(xué)者已通過(guò)SELDI-TOF-MS技術(shù)在宮頸癌、卵巢癌、大腸癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌等腫瘤中成功找到了新的腫瘤標(biāo)記物，建立相應(yīng)的腫瘤蛋白指紋圖診斷模型，其敏感度和特異度均比以往的腫瘤標(biāo)志物高，尤其是采用高分辨率質(zhì)譜儀并與統(tǒng)計(jì)方法的改進(jìn)相結(jié)合，其敏感度和特異度更高[2-3]。

在食管癌方面，許多學(xué)者同時(shí)研究了食管癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中血清蛋白變化，找到多個(gè)與疾病的發(fā)生、轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白[4-5]。我們已建立了浙江省患者食管鱗癌和宮頸鱗癌的診斷模型，發(fā)現(xiàn)食管癌和宮頸癌患者與健康志愿者相比，均有多個(gè)蛋白峰的差異值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但國(guó)內(nèi)外關(guān)于食管癌患者血清蛋白變化與預(yù)后關(guān)系的研究較少[6-7]。

本研究中92例存活期2年以上患者與52例存活期2年以下患者比較，蛋白峰的差異值無(wú)統(tǒng)計(jì)意義，這可能是由于所有患者分期不同，干擾因素太多造成。因此我們把Ⅱ期和Ⅲ期患者分別進(jìn)行分析，Ⅱ期45例存活期2年以上與14例存活期2年以下比較，有2個(gè)蛋白峰的差異值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Ⅲ期中22例存活期2年以上與29例存活期2年以下比較，有1個(gè)蛋白峰的差異值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示食管鱗癌患者血清蛋白質(zhì)譜的差異與患者的預(yù)后有一定關(guān)系。

3.3 食管癌患者血清蛋白水平與腫瘤分期的關(guān)系 我們還檢測(cè)了無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組患者和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組患者血清蛋白，兩者比較，有2個(gè)蛋白峰的差異值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組患者與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組的患者比較，有6個(gè)蛋白峰的差異值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示分期較早的食管癌患者與中晚期患者的血清中蛋白質(zhì)相對(duì)含量之間存在明顯的差異和梯度。某些蛋白質(zhì)表達(dá)的缺失可能是導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移的原因，提示這些蛋白質(zhì)可能是腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)標(biāo)記物。但我們也比較了有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組患者與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，兩者之間蛋白峰的差異值無(wú)統(tǒng)計(jì)意義。其原因可能在于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的中晚期食管癌患者也存在某些遠(yuǎn)處臟器的微轉(zhuǎn)移，但目前的技術(shù)手段還不能檢測(cè)出來(lái)。在研究中我們也發(fā)現(xiàn)存在治療前檢查未提示轉(zhuǎn)移的患者，術(shù)中探查發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移的情況，其中1例肝臟轉(zhuǎn)移，1例肺轉(zhuǎn)移。但本研究中遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移臟器樣本例數(shù)少（2例），可能存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的誤差。

目前有些學(xué)者也建立了不同人種的蛋白指紋圖診斷模型[8-9]。我們的研究也發(fā)現(xiàn)有家族史的食管癌與無(wú)家族史的食管癌患者之間有10個(gè)差異蛋白，且這些差異蛋白在有家族史的食管癌患者中均為高表達(dá)。作為浙江省食管癌高發(fā)區(qū)的天臺(tái)和仙居縣的患者與其他地區(qū)患者之間，其蛋白表達(dá)是否存在差異？我們正在研究中。

[1] Ren H,Du N,Liu G,et al.Analysis of variablitiec of serum proteomic spectra in patients with gastric cancer before and after operation[J].World J Gastroenterol,2006,12(17):2789-2792.

[2] Piyathilake C J,Oelschlager D K,Meleth S,et al.Plasma protein profiles differ between women diagnosed with cervical intraepithelial neoplasia(cin)1 and 3[J].Cancer Inform,2007,27(2): 345-349.

[3] Cadron I,Van G T,Amant F,et al.The use of laser microdissection and SELDI-TOF MS in ovarian cancer tissue to identify protein profiles[J].Anticancer Research,2009,29(4):1039-1045.

[4] 馮笑山,王立東,單探幽,等.食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)組學(xué)[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2007,42(3):397-399.

[5]Breton J,Gage M C,Hay A W,et al.Proteomic screening ofa cell linemodel of esophageal carcinogenesis identifies cathepsin D and aldo-keto reductase 1C2 and 1B10 dysregulation in Barretts' esophagus and esophageal adenocarcinoma[J].J Proteome Res, 2008,7(5):1953-1962.

[6] 夏婷,鄭智國(guó),高赟,等.宮頸癌患者血清蛋白指紋圖譜的檢測(cè)及其意義[J].癌癥,2008,27(3):279-282。

[7] 趙強(qiáng),鄭智國(guó),凌志強(qiáng),等.浙江采用血清蛋白指紋圖譜技術(shù)篩選食管鱗狀細(xì)胞癌特異相關(guān)性蛋白的研究[J].浙江醫(yī)學(xué),2011,33(11):1563-1566.

[8] 徐淑永,張瓊,張朝霞,等.新疆維吾爾族食管癌患者血清蛋白指紋圖譜診斷模型的建立[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2008,31(2)154-156.

[9] Liu L H,Shan B E,Tian Z Q,et al.Potential biomarkersfor esophageal carcinoma detected by matrix-assisted laser desorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry[J].ClinChemLabMed,2010, 48(6):855-861.

Correlation of differential expression of serum proteins with prognosis in patients with esophageal squamous cell carcinoma

Esophageal cancerProtein fingerprintPrognosis

2012-12-26）

（本文編輯：田云鵬）

310022 杭州，浙江省腫瘤醫(yī)院胸外科（江洪、趙強(qiáng)），化療科（王小紅），研究所（鄭智國(guó)）

王小紅，E-mail：hh737@126.com

【 Abstract】Objective To investigate the correlation of differential expression of serum proteins with progress in patients with esophageal squamous cell carcinoma. Methods The expression of serum proteins was analyzed by surface-enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (SELDI-TOF-MS)in 144 patients with esophageal squamous cell carcinoma and 50 healthy subjects.The correlation of differential expression of serum proteins and the prognosis of patients were analyzed. Results There were significant difference in expression of 10 serum proteins between cancer patients and healthy subjects.There were no significant difference in protein expression between patients who survived for＞2y(n=92)and those who survived＜2y(n=52).In patients with stageⅡcancer,the expression of two protein peaks was significant different between patients who survived for＞2y and patients who survived for＜2y;while in patients with stageⅢcancer one protein peak presented significant difference between two groups. Conclusion The differential expression of serum proteins in esophageal squamous cell carcinoma may be correlated with the prognosis of patients.