間歇缺氧大鼠NF-kBp65以及MCP-1的表達

徐曉梅 樊榮 黃曉穎 林乾頂 王良興

間歇缺氧大鼠NF-kBp65以及MCP-1的表達

徐曉梅 樊榮 黃曉穎 林乾頂 王良興

目的 探討間歇缺氧對大鼠血清以及心肌中NF-kBp65以及MCP-1含量的影響。 方法 清潔SD大鼠30只，隨機分成3組（每組10只）：正常對照組、間歇缺氧組、持續缺氧組，普通飼料飼養。正常對照組：常壓、常氧下飼養；間歇低氧組：每90s一循環，氧艙內低氧濃度維持在6%～8%，持續10s以上；持續低氧組：氧艙內氧濃度維持在8%～11%。每天早上9：00動物入艙，至下午5：00試驗結束，每天持續8h，連續35d。然后經右頸動脈抽血，處死大鼠分離其心臟，采用酶聯免疫吸附法（ELISA法）測定血清中NF-kBp65以及MCP-1含量，采用免疫印跡法測定大鼠心肌中NF-kBp65以及MCP-1的含量。 結果 與正常對照組相比，在間歇缺氧組以及持續缺氧組中大鼠血清以及心肌中NF-kBp65以及MCP-1的含量明顯增加。 結論 間歇缺氧可導致NF-kB的激活，從而導致大鼠血清以及心肌中NF-kBp65以及MCP-1的表達增加。

缺氧 心肌 NF-kBp65 MCP-1 大鼠

Hypoxia Heart muscle NF-kBp65 MCP-1 Rats

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（obstructive sleep apnea hyponea syndrome，OSAHS）以夜間反復發生的上氣道阻塞或狹窄而導致的間歇低氧血癥為臨床特征。研究發現，OSAHS是心血管疾病的獨立危險因素。OSAHS似乎與系統性炎癥有關[1]，這可能是導致心血管疾病的機制之一，而系統性炎癥的中心環節則是核因子-kB（NF-kB）。NF-kB是調節免疫反應、應激反應、凋亡和炎癥反應的中心環節。所以NF-kB激活可能是心血管疾病的始動機制。而缺氧可導致NF-kB激活。因此我們推測OSAHS可能通過間歇缺氧導致NF-kB激活，引起系統性炎癥反應，進而導致心血管疾病的發病率增加。

本研究模擬OSAHS患者的間歇缺氧狀態，測定間歇缺氧大鼠血清以及心肌中NF-kBp65以及單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）的含量，以明確缺氧狀態下炎癥蛋白的表達是否增加，進而導致心血管疾病發病率增加。

1 對象和方法

1.1 對象 由溫州醫學院動物試驗中心提供，共清潔SD雄性大鼠30只，按照體重相匹配隨機分為3組，每組10只。喂養均采用相同飼料，由溫州醫學院動物試驗中心統一提供。正常對照組：常壓、常氧下飼養；間歇低氧組：每90s一循環，氧艙內低氧濃度維持在6%～8%，持續10s以上；持續低氧組：氧艙內氧濃度維持在8%～11%。每天早上9：00動物入艙，至下午5：00試驗結束，每天持續8h，連續35d。

1.2 方法 研究結束后經頸內靜脈抽血法處死大鼠快速沿右室壁分離大鼠的左、右心室，稱取重量后置入塑料管中置入液氮罐中固定，然后轉移至-80°C冰箱中保存。采用酶聯免疫吸附法測定血清NF-kBp65、MCP-1含量。采用免疫印跡法測定大鼠心肌中NF-kBp65以及MCP-1的含量。首先收集心肌細胞，預冷的PBS洗滌2次，加入蛋白質抽提試劑輕輕搖動5min，加入裂解液，冰浴下搖動15min進行裂解，14 000g離心15min，采用BCA法進行蛋白定量。蛋白經SDS-PAGE電泳轉移至PVDF膜上，膜在5%BSA溶液中室溫孵育1h以封閉膜上的非特異結合。TBS/T洗膜3次，每次5min，封閉過的膜加入一級抗體4℃過夜，抗原抗體結合。TBS/T洗膜3次，每次5min，加入HRP標記的二級抗體以結合一級抗體，室溫孵育膜1h。TBS/T洗膜3次，每次5min。將膜置于反應液中室溫孵育5min。去除過量的溶液，將膜夾在兩塑料薄膜之間，以X線膠片曝光。圖片掃描保存為電腦文件。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件，計量資料采用表示，采用非參數檢驗符合正態分布，組間比較采用單因素方差分析，其中兩組間比較采用LSD法。

2 結果

2.1 3組大鼠血清中NF-kB以及MCP-1水平的比較 見表1。

表1 3組大鼠血清中NF-kB以及MCP-1水平的比較（ng/L）

由表1可見，與正常對照組比較，間歇缺氧組以及持續缺氧組大鼠血清中NF-kB以及MCP-1水平明顯升高，并且差異均有統計學意義（均P＜0.05），而間歇缺氧組以及持續缺氧組相比較，雖然間歇缺氧組比持續缺氧組血清NF-kB以及MCP-1水平表達有所增加，但無統計學意義。

2.2 3組大鼠心肌中NF-kB以及MCP-1的表達電泳圖 見圖1、2。

圖1 3組大鼠心肌NF-kBp65的表達電泳圖（N:正常對照組；CH：持續缺氧組；IH：間歇缺氧組）

圖2 3組大鼠心肌MCP-1的表達電泳圖（注釋同圖1）

由圖1、2可見，在間歇缺氧組以及持續缺氧組中，大鼠心肌NF-kBp65以及MCP-1表達增加，尤以在間歇缺氧組中明顯。

3 討論

OSAHS以夜間反復發生的上氣道阻塞或狹窄而導致的間歇低氧血癥為臨床特征。研究發現，OSAHS是心血管疾病的獨立危險因素。OSAHS似乎與系統性炎癥有關，這可能是導致心血管疾病的機制之一，而系統性炎癥的中心環節則是NF-kB。NF-kB是調節免疫反應、應激反應、凋亡和炎癥反應的中心環節[2]。

NF-kB是參與免疫與炎癥反應的重要轉錄因子，能被多種細胞外信號，包括缺氧所激活[3]。NF-kB迅速核移位，進入核內調節多種基因，包括多種細胞因子（TNF-a等）、急性時相蛋白（CRP）、黏附分子如細胞間黏附分子-1和血管內皮黏附分子-1等、趨化因子如單核細胞趨化蛋白-1等的表達，參與炎癥反應。

MCP-1屬于趨化因子家族中的C-C亞家族成員，單核細胞的趨化主要是由MCP-1來實現的，它能使血液中的單核細胞遷入內膜下，活化為巨噬細胞，吞噬脂質形成泡沫細胞，在動脈粥樣硬化（artheroscleros,AS）的早期起著重要作用。同時，在AS發生后期，MCP-1對于促進斑塊的不穩定也發揮著作用。MCP-1可由體內多種細胞分泌，包括平滑肌細胞、內皮細胞、單核細胞、巨噬細胞、脂肪細胞等，它能趨化多種炎性細胞向病變部位聚集，并對多種炎癥因子的刺激作出應答，從而直接或間接地參與了AS得形成。Martinovic等[4]對263例志愿者研究發現，血清MCP-1水平升高增加了冠狀AS的發病風險。

通過本研究發現，間歇缺氧確實可以使血清以及心肌中NF-kB以及MCP-1表達明顯增加，這可能是由于缺氧激活NF-kB成活化狀態，進而再激活其它炎癥因子如MCP-1等，導致系統性炎癥反應，從而導致缺氧狀態下心血管疾病發病率升高。這可能是OSAHS患者易發生心血管疾病的可能機制之一。

[1]Selmi C,Montano N,Furlan R,et al.Inflammation and oxidative stress in obstructive sleep apnea syndrome[J].Exp Biol Med, 2007,232(11):1409-1413.

[2]Williams A,Scharf S M.Obstructive sleep apnea,cardiovascular disease,and inflammation-is NF-kB the key[J]?Sleep Breath, 2007,11(2):69-76.

[3]Greenberq H,Ye X,Wilson D,et al.Chronic intermittent hypoxia activates nuclear factor-kappa B in cardiovascular tissues in vivo[J].Biochem Biophys Res Commun,2006,343(2):591-596.

[4]Martinovic I,Abegunewardene N,Seul M,et al.Elevated monocyte chemoattractaut protein-1 serum levels in patients at risk for cOr-onary artery disease[J].Circ J,2005,69(12):1484.

2011-12-12）

（本文編輯：沈昱平）

溫州市科技局資助項目（Y20090125）

325000 溫州醫學院附屬第一醫院呼吸內科

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the expression of NF-kBp65 and MCP-1 in serum and heart muscle in intermittent hypoxia rats. Methods There are thirty SD rats were randomly assigned into three groups:control group,intermittent hypoxia group and continuing hypoxia group,which were exposed to air,intermittent hypoxia and continuing hypoxia respectively 8h/d for 35d.Then the blood and heart samples were collected,and the NF-kBp65 and MCP-1 levels in serum and in heart tissue were measured with ELISA and Western blot respectively. Results Compared to the control group the contents of NF-kBp65 and MCP-1 in serum and heart were increased both in intermittent hypoxia group and continuing hypoxia group. Conclusion NF-kBp65 and MCP-1 in heart and blood of intermittent hypoxia rats,which may be associated with the activation of NF-kB by hypoxia.