泛素蛋白酶體系統對CVB3病毒性心肌炎小鼠的作用研究

張新民 陳鵬 張素勤 吳連拼 李岳春

泛素蛋白酶體系統對CVB3病毒性心肌炎小鼠的作用研究

張新民 陳鵬 張素勤 吳連拼 李岳春

目的 通過抑制CVB3病毒性心肌炎小鼠中泛素蛋白酶體途徑，研究泛素蛋白酶體系統在病毒性心肌炎發病中的作用機制。方法 將72只雄性BALB/c小鼠隨機分為心肌炎組（CVB組）、心肌炎+泛素蛋白酶體抑制劑MG-132處理組（CVB+T組）、正常對照組（Sham組）、正常對照+處理組（Sham+T組），每組各18只。前兩組腹腔接種CVB3病毒誘發急性心肌炎，后兩組腹腔注射PBS，CVB+T組和Sham+T組次日腹腔注射MG-132，0.75 mg/kg，連續給藥7d。第8天取材，觀察小鼠心肌組織病理變化，測定心肌CVB3病毒復制及血清肌鈣蛋白I（cTnI）、腦鈉肽（BNP）水平。 結果 心肌病理檢查顯示，Sham組與Sham+T組未見異常變化，CVB+T組心肌炎癥性浸潤和變性壞死較CVB組顯著減輕；心臟重量/身體重量比值CVB組為6.18± 0.40、CVB+T組為5.32±0.38，差異有統計學意義（P＜0.05）。cTnI、BNP水平CVB組為（3.88±0.08）μg/L、（3 002±256）pg/ml，CVB+T組為（1.52±0.05）μg/L、（1 506±142）pg/ml，CVB+T組均降低（均P＜0.05）；熒光定量PCR顯示CVB3 mRNA水平CVB組（1.42±0.06）高于CVB+T組（0.72±0.04）（P＜0.05）。 結論 抑制泛素蛋白酶體途徑減少了CVB3病毒復制，顯著減輕心肌炎小鼠心臟病理損傷，起到保護心肌的作用。

泛素蛋白酶體系統 小鼠 心肌炎

泛素-蛋白酶體系統（ubiquitin-proteasome system，UPS）不僅是細胞內蛋白質選擇性降解的主要途徑，是真核細胞內重要的蛋白質質控系統，而且參與細胞凋亡、抗原遞呈、細胞周期以及細胞內信號轉導等多種生理過程，對維持細胞的穩態具有十分重要的意義[1]。柯薩奇B3病毒（CVB3）是病毒性心肌炎最重要的致病病毒，在急性期導致心肌炎癥、壞死，并發心力衰竭及心律失常，可導致猝死及擴張性心肌病的發生。但目前病毒性心肌炎尚無特殊有效的治療方法[2]。最近的研究發現UPS在各種病毒感染性疾病中發揮了關鍵作用[3-5]，本文旨在研究UPS是否在CVB病毒性心肌炎發病過程中起了重要作用，并探討其中的作用機制。

1 對象和方法

1.1 實驗對象及試劑 4周齡雄性近交系SPF級BALB/ c小鼠，體重（17±2）g，購于浙江省實驗動物研究中心。CVB3病毒，滴度為107 TCID50/0.1ml。泛素蛋白酶體抑制劑MG-132為美國Calbiochem公司生產，0.75mg/kg，用3ml 0.2%的DMSO稀釋。使用的小鼠血清腦鈉肽（BNP）與肌鈣蛋白I（cTnI）ELISA試劑盒為深圳晶美生物工程有限公司提供，熒光定量PCR引物及試劑盒購于大連寶生物公司。

1.2 方法

1.2.1 分組方法 采用雙盲法隨機將72只小鼠分為4組：心肌炎組（CVB組），心肌炎+MG-132處理組（CVB+T組），正常對照組（Sham組），正常對照+MG-132處理組（Sham+T組），每組各18只。

1.2.2 藥物處理和標本采集 前兩組經腹腔注射100 TCID50/0.1 ml的CVB3稀釋液0.1 ml，后兩組腹腔注射等量0.1 mmol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）。CVB+T組和Sham+T組于接種病毒及膠腔注射PBS次日腹腔注射MG-132，0.75 mg/kg，連續給藥7 d。第8天時,眼球后靜脈叢取血，在心臟停跳前取心臟標本，將心臟沿左心室中線切為兩半，一半用10%甲醛固定待做病理組織學檢查，一半作real-time PCR檢查。

1.2.3 病理組織學檢查 將10%甲醛固定的小鼠心臟常規脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察心肌病理變化，其病變程度由2人分別判斷取平均值，判斷標準為：炎癥細胞浸潤，心肌壞死占每張心臟切片＜25%（+）計1分，25%~50%（++）計2分，51%~75%（+++）計3分，＞75%計4分。

1.2.4 CVB3 mRNA表達檢測 Trizol法提取小鼠心肌組織總RNA。引物由大連寶生物公司合成，各引物序列見表1。反轉錄cDNA及熒光定量PCR反應按大連寶生物公司試劑盒說明步驟完成，測得各基因的Ct值。根據2-△△Ct法進行相對定量分析，公式如下：F=2^-（待測組目的基因平均Ct值-待測組管家基因平均Ct值）-（所有組目的基因平均Ct值-所有組管家基因平均Ct值）。

表1 CVB3和β-actin的引物序列

1.2.5 BNP和cTnI含量測定 取小鼠血清，按小鼠BNP和cTnI ELISA試劑盒說明書步驟完成加樣后，把酶標板置于450nm的酶標儀上，讀取各孔的OD值。根據標準品與其相對應的OD（X）作出標準曲線及曲線方程，再根據標準曲線方程算出各樣品的BNP或cTnI（Y）的量。

1.3 觀察指標 觀察各組小鼠心肌病理組織學變化，心臟重量/身體重量（HW/BW），BNP、cTnI及心肌組織CVB3 mRNA的表達水平。

1.4 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以 表示，組間比較采用方差分析和t檢驗。

2 結果

2.1 各組小鼠心肌組織病理變化 CVB組可見明顯的炎癥性浸潤、心肌細胞變性壞死，Sham組與Sham+T組未見異常變化，而CVB+T組小鼠炎癥性浸潤、心肌細胞變性壞死較CVB組減輕（圖1，見插頁）。

2.2各組小鼠心肌病理組織學評分及HW/BW比值比較 見表2。

表2 各組小鼠心肌病理組織學評分及HW/BW比值比較

由表2可見，組織炎癥評分CVB+T組較CVB組減低（P＜0.01或0.05），兩組均較Sham組及Sham+T組高（P＜0.01）。CVB+T組HW/BW比值低于CVB組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 各組BNP、cTnI及CVB3 mRNA表達水平比較 見表3、圖2。

表3 各組小鼠BNP、cTnI及CVB 3mRNA的表達水平比較

圖2 CVB3 mRNA熒光定量PCR產物電泳結果（1：Sham組；2：CVB組；3：CVB+T組；4：Sham+T組；M：DL2000Marker）

由表3、圖2可見，與CVB組相比，CVB+T組BNP、cTnI水平較CVB組下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05），CVB組及CVB+T組的BNP和cTnI水平均較Sham組及Sham+T組升高，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。CVB組CVB3 mRNA表達水平高于Sham組、Sham+T組及CVB+T組，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。

3 討論

病毒性心肌炎目前尚無特殊有效的治療方法，一些免疫治療在隨機臨床試驗中對急性病毒性心肌炎患者多無療效，至今沒有找到一種特異性抗病毒的治療措施[2]。從其他途徑尋找對策，已成了國內外研究的重點。

UPS在各種病毒感染性疾病中發揮了關鍵的作用，各種病毒能利用和操控宿主細胞的基礎新陳代謝為自身所用[6]，因而UPS能在病毒復制周期和病毒宿主相互作用中起重要的作用。最近，國外研究UPS在病毒性心肌炎中的作用已有零星報道，但目前其機制還不清楚[3,7]。Gao等[7]研究顯示：泛素蛋白酶體抑制劑MLN353能減輕CVB3誘導的心肌炎癥和超微結構變化。Luo等[3]研究顯示，UPS是病毒性心肌炎心功能逐漸惡化的重要參與途徑。而Raaben等[8]的實驗結果似乎與上述研究結果不一致，他們發現泛素蛋白酶體抑制劑Velcade能增強冠狀病毒損傷作用。

本實驗在CVB3病毒性心肌炎小鼠模型上給予前期研究使用劑量的蛋白酶體抑制劑（0.75mg/kg），并連續使用7d，結果顯示：泛素蛋白酶體抑制劑MG-132能顯著減輕心肌炎小鼠心臟病理損傷，降低HW/BW比值，MG-132干預后第8天小鼠BNP、cTnI顯著降低，提示心肌炎癥損傷及壞死明顯減少，心功能改善。同時熒光定量PCR顯示CVB3 mRNA復制水平顯著降低，提示MG-132減輕心肌損傷的作用可能是通過抑制CVB3病毒復制實現的。

UPS是機體內重要的功能系統，隨著近年來對UPS研究的不斷深入，它在機體內的關鍵作用逐漸被發現[9]。本研究利用在體CVB3病毒性心肌炎小鼠模型，發現UPS在病毒性心肌炎中發病過程中起了重要的作用。泛素蛋白酶體抑制劑可能為急性病毒性心肌炎的一種新的治療方法，但仍需更加深入地研究。

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Effect of ubiquitin-proteasome system on acute viral myocarditis in mice

ZHANG Xinmin,CHEN Peng,ZHANG Suqin,et al.Depart-

ment of Cardiology,the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College,Wenzhou 325000,China

【 Abstract】Objective To investigate the effect of ubiquitin-proteasome system on acute viral myocarditis induced by coxsackievirus B3 (CVB3)in mice. Methods BALB/C mice were intraperitoneally inoculated with CVB3 to induce myocarditis. From 24 h after infection,MG-132 was administered at a dose of 0.75 mg/kg for 7d continuously by intraperitoneal injection.Normal controls were treated with same volume of PBS.Then,the myocardial histopathological changes,heart weight/body weight ratio(HW/BW),expression of myocardial CVB3 mRNA and serum cTnⅠand BNP levels were determined.Results Proteasome inhibitor MG-132 significantly attenuated myocardial lesions.HW/BW ratio was 6.18±0.40 in CVB group and 5.32±0.38 in MG-132 treatment group(CVB+T),respectively(P＜0.05).The levels of serum cTnⅠand BNP were 1.52±0.05μg/L and 1 506± 142pg/ml in CVB+T group,which were significantly lower than those in control group (P＜0.05).MG-132 also remarkably down-regulated CVB3 mRNA expression compared with CVB group(0.72±0.04 vs 1.42±0.06,P＜0.05).Conclusion MG-132 protects mice from viral myocarditis induced by CVB3,which is associated with down-regulation of CVB3 mRNA expression.

Ubiquitin-proteasome system Mice Viralmyocarditis

2012-06-01）

（本文編輯：馬雯娜）

國家自然科學基金資助項目（81200165）

325027 溫州醫學院附屬第二醫院心內科通信作者：李岳春，E-mail：liyuechun2560@sina.com