Gja5基因表達對小鼠下肢新生動脈生成影響機制的研究

王海濤 嚴志焜 許林海 胡志斌 潘曉華

Gja5基因表達對小鼠下肢新生動脈生成影響機制的研究

王海濤 嚴志焜 許林海 胡志斌 潘曉華

目的 研究Gja5基因表達在小鼠下肢新生動脈生成中的保護作用。方法 將168只Gja5基因敲除小鼠分為CX40基因敲除實驗組（Gja5-/-組），CX40雜合子組（Gja5+/-組）和對照組野生型小鼠（Gja5+/+組）3組，每組56只。另選擇增強型綠色熒光蛋白（EGFP）標記的Gja5基因小鼠20只。在熒光顯微鏡下觀察EGFP標記的Gja5基因在小鼠動脈的表達，建立小鼠下肢股動脈閉塞模型，應用激光多普勒血流儀（LDF）動態監測股動脈結扎術前，術后當天及術后1、3、7、14、21d下肢缺血區域的血流恢復情況，同時使用RT-PCR法檢測Gja5基因在小鼠下肢腓腸肌的表達。結果 EGFP標記的Gja5基因（CX40基因）表達在小鼠的腦動脈和股動脈上。在股動脈結扎術后1、3、7、14、21d，Gja5-/-組小鼠的患肢血供較Gja5+/+組明顯減少。在股動脈結扎術后3d時，Gja5基因在小鼠下肢腓腸肌的表達升高了約4倍，術后7d時逐漸回到基線水平。 結論 Gja5基因表達在小鼠下肢新生動脈生成中發揮了重要的保護作用。

Gja5 基因 小鼠 下肢 新生動脈生成

缺血性心血管疾病是目前發達國家及眾多發展中國家中成人最常見的死因之一[1]，所以新生動脈生成和修復機制的研究對于缺血性心血管疾病具有重大意義。促進代償性血管重建是富有前景的治療新策略[2]。縫隙連接（GJ）是含有多種細胞間通道的特殊膜結構，容許離子、小分子代謝產物、第二信使等通過，是調節血管功能的一種關鍵因子[3-4]。GJ參與細胞間物質交換的代謝偶聯和電信號傳遞的電偶聯，進行細胞間信息傳遞（GJIC），在細胞的生長、分化、生理功能的調節中發揮作用[5-6]。體內研究證實Gja5基因作為組成的跨物種和血管床的縫隙連接蛋白CX40，在血管壁細胞之間的耦合鏈接中發揮重要的作用，但Gja5基因縫隙連接蛋白CX40的具體調控機制尚不知曉[7]。本研究通過熒光顯微鏡下觀察增強型綠色熒光蛋白（EGFP）標記的Gja5基因在小鼠動脈的表達，研究其在小鼠下肢新生動脈生成中的保護作用，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物分組及模型建立

1.1.1 實驗動物 所有實驗小鼠均來自于德國MDC生物醫學中心，清潔級。體重25～35（28.35±0.81）g，雌雄不拘；無人畜共患疾病，共188只。其中Gja5基因敲除小鼠（Gja5基因敲除組）168只，Gja5 EGFP小鼠（CX40 EGFP組）20只。將Gja5基因敲除組小鼠分為3個亞組：CX40基因敲除實驗組（Gja5-/-組），CX40雜合子組（Gja5+/-組）和對照組野生型小鼠（Gja5+/+組），每組56只。1.1.2 建立小鼠下肢股動脈閉塞模型（血流驅動的新生動脈生成動物模型）（1）麻醉：采用氯胺酮100mg/kg（100mg/ml）和甲苯噻嗪10mg/kg（20mg/ml）行腹腔注射麻醉，麻醉完成后小鼠平臥在操作臺上，局部溫度保持37℃，雙足采用膠布固定，雙眼使用眼藥膏保護。（2）手術：小鼠右腹股溝手術區使用脫毛霜脫毛，70%乙醇消毒。平行股動靜脈方向行皮膚切口0.5cm，確定股神經，股動脈和股靜脈血管神經束。暴露股動脈、股靜脈和股神經，并小心分離。根據Hoefer[8]的方法雙重結扎股動脈。多數情況下的近端旋股動脈和側尾鰭股動脈緊密相連。于這兩個分支的近端第1次結扎，兩個分支遠端第2次結扎。在第2次結扎點遠端位置，股動脈分為隱動脈和腘動脈，最后縫合手術切口（圖1）。

圖1 小鼠手術示意圖

1.2 方法

1.2.1 激光多普勒血流成像技術（LDF）評估血流灌注情況 采用英國Moor設備有限公司的MoorLDI2-HR高分辨率成像儀。股動脈被結扎后，采用非侵入性的LDF動態監測下肢缺血區域的血流恢復情況。其中多普勒信號與皮膚上直徑為200～300μm的血管內血流灌注量成正比。比較對側（非結扎側）的肢體，研究區域組織灌注的量化，顯示為彩色編碼的圖像。結合肢體灌注的其他測量措施，從足部獲得相關的彩色編碼的圖像。小鼠被麻醉后，應用LDF動態監測并記錄股動脈結扎術前、術后當天及術后1、3、7、14、21d下肢缺血區域的血流灌注量。血流灌注量的單位以PU表示。

1.2.2 Real-time RT-PCR檢測 在股動脈結扎術后7d，以頸椎脫臼法處死Gja5+/+組和Gja5+/-組小鼠各8只，從股動脈結扎側和非結扎側的大腿和下肢剝離皮膚和筋膜，分離和切除腓腸肌，立即冷凍在液氮中并儲存于-80℃冰箱。采用Trizol試劑提取腓腸肌的總RNA。基于德國BioTez有限責任公司生產的TaqMan探針，開始進行Real-time RT-PCR檢測。并根據使用說明書，通過TaqMan基因表達MasterMix序列檢測系統進行實時PCR擴增反應。PCR擴增反應被重復測試3次。甘油磷酸鹽脫氫酶被正常化后，計算mRNA的相對值。采用Primer Express 2.0軟件設計引物和探針序列。

1.2.3 Real-time RT-PCR檢測 Gja5小鼠實時RTPCR法（5′to 3）正向引物：CAGCCTGGCTGAACTCTACCA。反向引物：CTGCCGTGACTTGCCAAAG。Taq-Man探針：CGCTGTCGGATCTTCTTCCAGCCCAG。Gja5基因敲除小鼠基因型引物（5′to 3）正向引物：TGGAGCCACAGTTGCAATGGT。反向引物（Gja5-/-組）：TCTCTGACTCCGAAAGGCAG。反向引物（Gja5-/-組）：GCACGAGACTAGTGAGACGTG。

1.3 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件。正態分布的計量資料以表示。Gja5-/-組和Gja5+/+組的組間比較、Gja5+/-組和Gja5+/+組的組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 Gja5基因的表達 Gja5基因在小鼠的腦動脈Willis環上（圖2）和在小鼠的股動脈上（圖3）的表達。

圖2 Gja5基因在小鼠的腦動脈Willis環上的表達

圖3 Gja5基因在小鼠的股動脈上的表達

2.3 Gja5+/+組、Gja5-/-組及Gja5+/-組 3組間通過LDF成像比較下肢缺血區域的血流灌注量，結果見表1。3組術后3d和7d下肢缺血區域的血流灌注圖像，見圖4、5。

由表1可見，在股動脈結扎術前，Gja5+/+，Gja5+/-及Gja5-/-3組之間的患肢血供差異無統計學意義（均P＞0.05）；在股動脈結扎術后1、3、7、14、21d，Gja5+/+組與Gja5-/-組比較，小鼠的患肢血供恢復差異均有統計學意義（均P＜0.05），而Gja5+/+組和Gja5+/-組比較，小鼠的患肢血供恢復差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

2.4 Gja5基因在小鼠下肢腓腸肌的表達 Gja5基因在小鼠下肢腓腸肌的表達顯示為結扎側/非結扎側的比值。在股動脈結扎術后3d，Gja5基因在Gja5+/+和Gja5+/-兩組間腓腸肌的表達均升高了約4倍（4.015±0.036，4.241±0.125），股動脈結扎術后7d，其表達均逐漸回到基線水平（1.0）。Gja5+/+和Gja5+/-兩組的Gja5基因在小鼠下肢腓腸肌的表達差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 3組通過LDF成像比較下肢缺血區域的血流灌注量（PU）

圖4 股動脈結扎術后3d各組LDF灌注圖像

圖5 股動脈結扎術后7d各組LDF灌注圖像

3 討論

當前冠心病的治療仍依賴各類藥物擴張血管，此種方法不能阻斷病程的發展，最后往往不得不施行血管再通或旁路搭橋手術。由于再通后的冠狀動脈及移植的旁路血管易再次阻塞且不適于病變廣泛的病例，所以這類手術的應用受到一定的限制。外周血管栓塞性疾病如血栓閉塞性脈管炎由于缺乏有效的治療方法，使很多患者付出了截肢的代價。血管重建包括血管發生、血管新生及動脈生成，是機體在血管閉塞狀態下的病理生理性代償反應。以改善缺血為目的，應用促血管因子、基因治療和血管祖細胞補充治療已成為當前缺血性血管疾病治療的研究熱點[9-10]。動脈生成是指由于動脈阻塞，血流再分配使側支微動脈血流量增加、血管內剪切力增加，引起細胞增殖、血管重塑，從而形成大的有功能的側支動脈的過程，所形成的動脈能夠有效地恢復動脈阻塞所致缺血區的血液供應[11-15]。側支動脈生成比血管新生更重要，促進側支動脈生成，恢復缺血區的血液供應及改善組織細胞的氧和營養物質供給，能夠全面的治療缺血性血管疾病，它將成為缺血性血管疾病治療的發展方向[16]。

GJ是含有多種細胞間通道的特殊膜結構，每個GJ由來自相鄰細胞膜上的2個縫隙連接半通道，也稱為連接子組成，每個連接子由6個連接蛋白分子構成6聚體蛋白質，中間包繞水相孔道，形成一個在相鄰細胞漿可進行離子和小分子物質交換的孔道和低阻的電沖動通道[17]。GJ在血管發育和血管功能中發揮了多方面的作用，也參與了神經發生和血管生成[18]。

為了證實Gja5基因在新生動脈形成中的調節作用，我們使用Gja5基因突變小鼠，并建立血流驅動的新生動脈形成模型，股動脈閉塞模型[8]。在一個特定的位點結扎股動脈，從而觸發了結扎點近端小的且預先存在的側支動脈轉化成有功能的新生動脈，以及遠端的缺血性血管新生。下肢缺血后的血管反應，可以很容易地被LDF和新生動脈形成的組織學的指標來評估。本研究中，通過熒光顯微鏡觀察EGFP標記的Gja5基因在小鼠動脈的表達。使用Gja5 EGFP小鼠，我們可以發現Gja5基因表達在小鼠的腦動脈Willis環和股動脈上。通過LDF檢測，我們發現在股動脈結扎術后1～21d，Gja5+/+組和Gja5-/-組小鼠的患肢血供恢復的差異有統計學意義，而Gja5+/+組和Gja5+/-組小鼠的患肢血供恢復差異無統計學意義。從而認為Gja5基因在新生動脈生成中發揮了重要的調節功能，可作為動脈標記物。在股動脈結扎術后3d，Gja5基因在腓腸肌的表達升高了4倍，股動脈結扎術后7d，在缺血后肢，無論是在Gja5+/-小鼠和Gja5+/+小鼠，其表達水平均逐漸恢復到基線水平。有趣的是，Pipp等[19]在豬的缺血后肢新生動脈生成模型中發現非常高的流體切應力（FSS）水平和豐富的側支循環，從而表明了FSS的重要性，通常情況下，在以后各階段的動脈生成中，隨著新生動脈的直徑增大，FSS逐漸下降至正常水平，可防止新生動脈直徑進一步增長，從而達到最佳適應。Pipp等[19]發現，在他們的動靜脈分流模型中，進一步持續升高FSS，可顯著增加新生動脈的直徑大小，由此，我們可以發現，Gja5基因表達在股動脈閉塞模型上的變化趨勢與FSS在動脈生成上的變化趨勢是相同的，從而確立了FSS是新生動脈生成的激發因素。因此，我們認為，Gja5在新生動脈生成中發揮了重要的職能作用，但需要進一步的研究股動脈閉塞后Gja5表達和FSS變化之間的關系。另外Gja5表達在動脈內皮細胞介導的血管舒張反應可能影響到患肢灌注減少。因此，要研究這個功能的參與，我們也需要進一步研究在小鼠動脈內皮細胞特異性的基因敲除Gja5基因的表達。Gja5在新生動脈生成中發揮了重要的調節功能，可作為動脈標記物。

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Relationship between Gja5 gene expression and arteriogenesis in mouse hindlimb

Objective To investigate the relationship between the gene expression of Gja5(connexin-40,CX-40)and arteriogenesis on the hindlimb in mice．Methods One hundred and sixty eight mice were used in the study,including 56 CX40 knockout mice(Gja5-/-group)，56 CX40 heterozygous mice(Gja5+/-group)and 56 wild-type mice(Gja5+/+group)．The hindlimb blood flow blockage was induced by femoral arteries occlusion(FAO)．The scanning Laser Doppler Flow Imager was used to observe the expression of Gja5 in Gja5 EGFP reporter animals through fluorescent microscope．Gja5 gene expression was also detected in gastrocnemicus（GC）muscle by real-time RT-PCR before and 1,3,7,14,21d after FAO．Results The Gja5 gene was expressed in mouse arteries including cerebral artery and femoral artery．There were significant reductions for hindlimb perfusion in Gja5-/-mice compared to Gja5+/+mice at d1,3,7,14 and 21 after FAO．The expression levels of Gja5 in Gja5+/-mice and Gja5+/+mice in GC muscle were both increased 4-fold in the ischemic hindlimb at d3 after FAO．Then the expression levels of Gja5 returned to baseline values at d7 after FAO．Conclusion Arterial Gja5 expression may be involved in the arteriogenesis of ischemic hindlimb of mice．

Gja5 Gene Mice Hindlimb Arteriogenesis

2012-08-23）

（本文編輯：楊麗）

浙江省錢江人才計劃D類項目（QJD1202017），浙江省醫藥衛生平臺重點資助計劃項目（2013ZDA003）

310014 杭州，浙江省人民醫院心胸外科

王海濤，E-mail：wanght1974@hotmail.com