FasL基因-844T/C單核苷酸多態性與浙江地區食管鱗癌易感性關系的研究

王黎芳 趙宏光 李昕如 伊媛琪

FasL基因-844T/C單核苷酸多態性與浙江地區食管鱗癌易感性關系的研究

王黎芳 趙宏光 李昕如 伊媛琪

目的 研究FasL基因啟動子區-844T/C單核苷酸多態性（SNP）與食管鱗癌易感性的關系。方法 提取248例食管鱗癌患者（患者組）和297例健康體檢者（對照組）外周血基因組DNA，以PCR-RFLP檢測FasL-844T/C SNP。分析、比較兩組該位點SNP的表達差異。結果 食管鱗癌患者與健康體檢者的FasL基因啟動子區-844位點基因型分布差異有統計學意義（P＜0．01）。以TT基因型為對照，TC基因型不增加食管鱗癌患病風險（P＞0．05），而CC基因型則顯著減少食管鱗癌患病風險（調整后OR=0．425，95%CI=0．255～0．708，P＜0．01）。以T等位基因為對照，C等位基因顯著減少食管鱗癌患病風險（調整后OR=0．597，95% CI=0．460～0．776，P＜0．01）。結論 在浙江地區人群中FasL基因-844T/C SNP與食管鱗癌的易感性有關。

FasL基因 單核苷酸多態性 食管癌

細胞凋亡對人體器官發育、機體穩態及維持器官正常功能均發揮著重要的作用。研究顯示，凋亡途徑調節缺陷可導致腫瘤形成、浸潤及轉移[1]。細胞凋亡途徑中關鍵基因的遺傳學變異可影響腫瘤易感性。Fas-Fas配體（Fas ligand,FasL）系統是細胞和組織凋亡的主要途徑，同時在免疫逃逸中發揮著重要作用，在癌發生、發展中起到重要作用。FasL是腫瘤壞死因子超家族的一員，與其受體Fas交聯后能觸發凋亡級聯反應，引起Fas抗原表達細胞凋亡。FasL表達的增加會推動細胞的惡性轉化及進展。影響凋亡信號傳導的FasL基因功能性突變與多種類型癌發生的危險性相關[2]。

單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNP）對腫瘤的遺傳易感性起到了重要作用。功能性SNP能改變基因表達及酶活性，影響腫瘤患病風險。Fas或FasL途徑的SNP能夠改變FasL的表達，在腫瘤遺傳易感性中起到重要作用。本研究擬通過檢測浙江地區食管鱗癌患者FasL基因啟動子區-844T/C（rs763110）SNP，探討該基因SNP與食管鱗癌易感性的關系，以期為食管鱗癌的發生、發展提供理論依據。

1 對象和方法

1.1 研究對象 選取2008-01—2011-10收治入浙江省腫瘤醫院胸外科的食管鱗癌患者248例（患者組）。男215例，女33例，年齡46～76（61.4±6.5）歲。另選擇同期健康體檢者297例（對照組），男179例，女118例，年齡41～78（56.6±7.9）歲。在知情同意的情況下，每例抽取外周血3ml，肝素抗凝。

1.2 方法

1.2.1 提取基因組DNA 按照Blood Genome DNA Extraction Kit（購買自日本Takara公司）的操作說明提取基因組DNA。提取的樣本DNA以TE緩沖液溶解，于-20℃保存。

1.2.2 PCR擴增 PCR擴增引物引物序列如下：正向引物（Fw Primer）：5′-CAGCTACTCGG AGGCCAAG-3′；反向引物（Rev Primer）：5′-GCTCTGAGGGGAGAGACCAT-3′。引物由上海英維杰基生物有限公司合成。PCR擴增試劑盒購自美國Invitrogen公司。反應體系（100μl）為：PCR Premix 50μl，Fw Primer 1μl，Rev Primer 1μl，DNA模板2μl，滅菌雙蒸水46μl。反應條件：94℃預變性2min，隨后94℃變性30s、62℃退火30s、72℃延伸45s共35個循環，72℃最終延伸7min。反應結束后，取10μl PCR產物于3%瓊脂糖（購買自日本Takara公司）凝膠電泳分析，Gelred（購買自美國Biotium公司）染色，凝膠成像系統觀察目的條帶，以確保有效擴增。隨機抽取各組樣本量10%的PCR產物送上海生工測序，測序結果應用 Pubmed BLAST程序（http://blast/ncbi/nlm/nih/gov/ Blast/cgi）搜索同源序列，確認目的片段擴增無誤。

1.2.3 限制性片段長度多態性檢測 按照DNA Fagment Purification Kit（購買自日本Takara公司）操作，對PCR后的產物進行純化。純化后產物于3%瓊脂糖電泳下進行分析，確保有效純化。膠回收純化后的PCR擴增產物以限制性核酸內切酶BsrDI（購買自美國NEB公司）酶切。酶切反應體系（20μl）為：10×NEB緩沖液2μl，DNA 6μl，100×BSA 0.2μl，內切酶0.5μl，滅菌雙蒸水11.3μl；65℃水浴酶切4h。酶切產物于3%瓊脂糖凝膠電泳分析，Gelred染色，凝膠成像系統觀察目的條帶。

1.3 統計學處理 采用SPSS16.0統計軟件。計數資料以頻數與百分率表示。Hardy-Weinberg平衡檢測樣本人群該基因是否符合遺傳平衡法則而具有恒定性。不同基因型患者的年齡、性別等差異比較均采用χ2檢驗。所有統計檢驗均為雙側概率檢驗。

2 結果

2.1 FasL-844T/C多態性檢測 以248例患者和297例健康人外周血基因組DNA為模板擴增FasL-814啟動子區，目的片段長度為401bp（圖1）。經BsrDI酶切，TT未突變純合子（野生型）能完全被酶切，電泳條帶為二條122bp、104bp；CC突變純合子（突變型）不能被酶切，電泳條帶為一條，分子量大小為401bp；TC雜合子電泳條帶包含以上3種分子量條帶（圖2）。隨機送樣本測序進一步驗證-844位突變（圖3）。

圖1 PCR擴增FasL啟動子區（1～7：患者組樣本，M：DNA Marker）

圖2 BrsDI酶切檢測FasL基因-844T/C多態性（2、4、6、8、10、12、14、16、19、22：未酶切產物；1、3、13、15、17、21、23：TT純合子；5、9、11、18、20：TC雜合子；7：CC純合子；M：DNA Marker）

2.2 基因頻率分析及SNP與食管鱗癌關系分析 患者組和對照組在年齡、性別構成中差異有統計學意義（P＜0.05）。患者組及對照組的TT、TC和CC 3種基因型構成比以及等位基因頻率的比較見表1。鑒于隨機樣本在年齡與性別上差異有統計學意義，故在測算患病風險率（OR值）時以年齡和性別參數加以調整。

由表1可見，兩組間三種基因型的分布差異有統計學意義。對照組基因型頻率符合Hardy-Weinberg平衡（χ2=2.663，P=0.103＞0.05），表明所選樣本具有群體代表性。患者組基因型TT∶TC∶CC=27.8%∶44.4%∶27.8%，對照組TT∶TC∶CC=17.5%∶43.1%∶39.4%，兩組基因型比較差異有統計學意義（P＜0.01）。患者組T等位基因∶C等位基因=50.0%∶50.0%，對照組T等位基因∶C等位基因= 39.1%∶60.9%，兩組基因頻率比較差異有統計學意義（P＜0.01）。以TT基因型為對照，TC基因型不增加食管鱗癌患病風險，其OR值為0.957，95%CI為0.599～1.527，P=0.852。調整后的 OR值=1.081，95%CI為0.640～1.826，P=0.771。而CC基因型則顯著性減少食管鱗癌患病風險，OR值為0.436，95%CI為0.271～0.702，P=0.001；調整后OR值=0.425，95%CI為0.255～0.708，P=0.001。以T等位基因為對照，C等位基因顯著性減少食管鱗癌患病風險，OR值為0.587，95%CI為0.454～0.758，P=0.000；調整后OR值=0.555，95%CI為0.419～0.735，P＜0.01。

圖3 FasL基因-844T/C PCR產物測序（A：122為G B：123為T）

表1 兩組基因型構成及等位基因頻率的比較[例（%）]

2.3 不同研究數據的差異分析 將以上數據與Sun等[19]報道的FasL基因啟動子區-844T/C SNP數據進行對照分析，見表2。

表2 本文數據與Sun等報道的數據的對照分析

由表2可見，患者組與對照組在基因型的比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）；患者組的基因型比較差異有統計學意義（P＜0.01），對照組差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

FasL基因定位于染色體1q23,包含4個外顯子。它是一種40kD（281個氨基酸殘基）的二型細胞表面糖蛋白，包括胞漿區，跨膜區以及胞外區。FasL的胞外區與FAS的胞外區結合，能觸發凋亡級聯反應，引起Fas抗原表達細胞的凋亡。FasL主要表達于NK細胞、激活的T細胞，以及眼、腦、生殖器官等免疫豁免細胞。FasL具有高度的多態性。研究最廣泛的多態性是位于FasL啟動子區-844T/C（rs763110）。此功能多態性位于假定的CAAT增強子結合蛋白β轉錄因子結合模體。FasL-844T＞C能影響FasL的啟動子活性，這種變異能強烈影響FasL的表達。FasL-844 C等位基因比FasL-844 T等位基因人群的FasL基礎表達增高[3]。提示FasL-844 T/ C多態性會影響FasL的表達及FasL介導的信號，最后影響腫瘤易感性。

人們已經發現在多種腫瘤中有FasL表達增多現象[4-6]，FasL表達的增高與腫瘤形成、腫瘤侵襲行為以及免疫逃逸有關。腫瘤組織中FasL表達增高與各種腫瘤預后不良有關。動物實驗顯示，以FasL的抗體阻斷FasL的作用將導致腫瘤負荷以及克隆形成效價顯著性減少[7]。

FasL高表達可通過兩種機制造成免疫逃逸：（1）通過殺傷Fas敏感的淋巴細胞來增加腫瘤細胞反攻免疫系統的能力，從而與癌的發展有關[4-8]。（2）T淋巴細胞的激活誘導的細胞死亡（Activation-induced cell death，AICD）可以造成淋巴細胞的自身凋亡，幫助腫瘤細胞逃逸T淋巴細胞的殺傷作用。FasL-844C等位基因導致T淋巴細胞FasL高表達，這可以使T淋巴細胞的AICD作用增強，導致有效的免疫監視作用減弱，從而增加腫瘤的易感性[9]。

研究顯示，FasL-844T/C SNP與肺癌、宮頸癌、膀胱癌、乳腺癌、胰腺癌等腫瘤患病風險增加有關[10-14]。有一項薈萃分析提示，FasL-844C等位基因與增加腫瘤的患病風險相關[15]。另一項病例對照研究提示，FasL-844T等位基因可能對腫瘤的患病風險起到了保護作用[16]。但也有研究顯示不同的結論。Ter-Minassian等[17]研究發現，60歲以下FasL-844 T/C或T/T基因型人群與C/C基因型人群相比較，非小細胞肺癌患病風險顯著增高。Lei等[18]研究發現FasL-844 CT/TT基因型與FasL-844CC基因型相比較，能顯著增加頭頸部鱗癌后第二原發性癌的患病風險。Sun等[19]研究了588例食管鱗癌患者的的FasL-844T/C SNP與食管鱗癌易感性的關系，并以648例健康人作為正常對照。研究顯示，FasL-844 CC基因型人群與FasL-844TT基因型人群相比較，食管鱗癌患病風險顯著增高。

本研究顯示患者組和對照組無論是在基因型還是等位基因頻率上差異均有統計學意義。按照基因型進行比較，以TT基因型為對照，CC基因型的粗OR為0.436，考慮到年齡和性別在兩組間有差異，根據年齡、性別調整后的OR為0.425，差異依然有統計學意義。提示CC基因型是食管鱗癌易感性的保護性因素。按照等位基因頻率進行比較，C等位基因也是食管鱗癌易感性的保護性因素。

本研究與Sun等報道的FasL-844 T/C SNP與食管鱗癌易感性相關性研究的結果有差異。因此，我們將本研究數據與Sun等報道的FasL基因啟動子區-844T/ C SNP數據進行統計學分析。除對照組等位基因分布在兩個研究中無差異以外，其余分布均存在差異。我們認為，第一，兩個研究中研究的地區不一樣，人的基因型可能有所差異。有研究顯示，不同地區，不同種族FasL-844 T/C SNP有所差異。第二，我國南北方食管鱗癌的發病因素可能有所差異。第三，FasL-844 CC基因型人群的淋巴細胞的FasL表達較高，同時，有研究顯示正常食管黏膜細胞也有FasL表達，這些可能是對食管鱗癌的保護性屏障。正常機體較高的FasL表達水平可能對食管的細胞轉化有防御作用。

本研究結果顯示FasL-844 CC基因型是食管鱗癌易感性的保護性因素，C等位基因也是食管鱗癌易感性的保護性因素，在浙江地區人群中FasL基因-844T/C SNP可能與食管鱗癌的易感性有關。

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FasL gene-844T/C mutation in relation to susceptibility of esophageal cancer in Zhejiang Province

Objective To explore the relationship between FasL gene-844T/C single nucleotide polymorphism（SNP）in promoter and susceptibility of esophageal cancer in Zhejiang Province． Methods The clinical data of 248 patients with esophageal squamous cell carcinoma admitted in Zhejiang Cancer Hospital from January 2008 to October 2011 were collected and 297 healthy individuals were selected as normal controls．Genomic DNA was extracted from peripheral whole blood．PCR-RFLP technique was carried out to detect FasL-844T/C SNP．χ2test and logistic regression was carried out for analysis．Results There was significant difference in genotypes of FasL gene promoter-844 locus between patients and controls(P＜0．05)．CC genotype significantly reduced the prevalence of esophageal squamous cell carcinoma risk(adjusted OR=0．425,95% CI 0．255～0．708,P＜0．01)．Compared to T allele,C allele significantly reduced the prevalence of esophageal squamous cell carcinoma risk（adjusted OR=0．597,95%CI 0．460～0．776,P＜0．01）．Conclusion FasL gene-844T/C SNP is associated with the occurrence of esophageal squamous cell carcinoma in population of Zhejiang Province．

FasL gene SNP Esophageal cancer

2013-02-20）

（本文編輯：楊麗）

2013年浙江醫學高等專科學校科研基金，2012年浙江省自然科學基金（LQ12H16001）

310053 杭州，浙江醫學高等專科學校基礎醫學部（王黎芳，伊媛琪）；浙江省腫瘤醫院胸外科（趙宏光）；浙江中醫藥大學藥學院（李昕）

趙宏光，E-mail：zhaohg75@126.com