不同手術時間對骨折愈合過程中VEGF表達的影響

董黎強 尹航 王維佳 王昌興 胡偉鋒

不同手術時間對骨折愈合過程中VEGF表達的影響

董黎強 尹航 王維佳 王昌興 胡偉鋒

目的觀察不同手術時間對實驗大鼠骨折愈合過程中血管內皮細胞生長因子（VEGF）表達的影響。方法對192只大鼠股骨進行閉合骨折造模，在造模后第1、3、5、7、11、14天分別對骨折采取切開復位內固定手術，并在骨折后第1、3、5、7、11、14、21、35、49天對大鼠骨折端進行VEGF免疫組化染色觀察，對其表達結果進行統計分析。結果手術操作干預了實驗大鼠骨折愈合不同階段VEGF的表達強度及表達時間。第7、11天手術組能較好地促進骨折端VEGF表達，且能持續更長時間，第14天手術組次之。第5天手術組僅在表達強度上高于未手術組，當天手術組與未手術組則無明顯差別。而第3天手術組在骨折愈合的各階段均處于較低水平，且低于未手術組。結論手術操作時機能影響實驗大鼠骨折端VEGF的表達，可能導致二次損傷加速現象，但最佳手術時機在第1～2周時段，骨折后幾天內即進行手術操作可能不利于骨折的愈合。

骨折愈合 血管內皮細胞生長因子 手術時間

【 Abstract】 ObjectiveTo observe the effect of time interval of operation on the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)in bone during fracture healing in rats．MethodsClosed femoral fracture was induced in 192 Wistar rats．The fracture was treated with open reduction and internal fixation operation at 1,3,5,7,11 and 14d after fracture．The expression of VEGF in fracture end at different time points(d1,3,5,7,11,14,21,35 and 49)were detected with immunohistochemical staining．ResultsThe expression of VEGF was strongest and last longer in rats operated at d7 or d11 after fracture,followed by those operated at d14．The expression intensity was higher in rats operated d5 after fracture than those without operation．There was no difference in VEGF expression between rats operated at d1 and non-operated rats;while rats operated at d3 presented low VEGF expression at all time points of fracture healing，which even lower than that in rats without operation．ConclusionThe results suggest that the optimal timing of surgery may be within the 1～2 weeks after fracture．

目前，隨著接骨學的發展，骨折的治療與手術切開復位內固定之間存在著密不可分的關系。調查表明，手術治療的患者發生骨不連的概率比保守治療的患者高出4倍[1]。通常人們會籠統的認為手術切開會過多地剝離骨膜損傷局部血供，對于骨折愈合是一個不利因素，但很少有人從手術的時機上加以考慮。我們在臨床工作中發現一些過早手術的患者骨折端出現了骨愈合不良或骨不連接，而適當延遲手術的患者反而愈合得更好。由此我們認為手術治療的效果不僅僅與局部的血運有關，而且還與手術時機有著密切的關聯。因此，我們進行了本項實驗，期望對骨折二次損傷加速現象的分子生物學基礎作一初步的研究，并對骨折最佳手術時間作進一步探索。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 選用Wistar大鼠192只，體重220g左右，由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供。飼養條件一致，室溫（24±2）℃，標準飼料（由南京安立默科技有限公司生產），自由攝食、飲水。全部動物經適應性喂養1周以上無異常后開始正式實驗。

1.2 主要實驗儀器 改良的Einhorn造模支架；LEICA RM2035型切片機；全自動脫水機；Olympus BX50熒光顯微鏡；IPP計算機真彩圖像分析系統；即用型SABC試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司產品）。

1.3 方法

1.3.1 制作閉合骨折模型 將192只大鼠用10%戊巴比妥鈉腹腔內按40mg/kg注射，麻醉后取右下肢髕骨內側切口縱行切開,將髕骨牽向外側使之脫位，暴露股骨髁間凹。逆行插入克氏針（直徑1mm），從大轉子及皮膚穿出，克氏針遠端埋于股骨髁間骨皮質下，近端緊貼大轉子將尾部折彎，多余部分剪除后逐層閉合切口。將動物右下肢外展內旋位固定于閉合骨折模型打擊器的鐵砧凹槽上(鐵砧凹槽間距為15mm)，造模支架中柱下端的骨刀壓于大腿中部,助手提起500g的砝碼至20cm處，讓其自由落體撞擊中央鋼板[2]，致股骨中段骨折。術后立即在麻醉狀態下拔出克氏針，用拇指和示指按摸骨折端，了解骨折類型，要求骨折類型為股骨中段橫行及短斜形骨折。造模不合格的大鼠予以剔除，并及時補充。1.3.2 動物分組及閉合骨折開放復位內固定操作 將符合條件的192只已制作閉合骨折模型的大鼠采用完全隨機法分為以下7組：未手術組A，36只；骨折后第1天（當天）手術組B，36只；骨折后第3天手術組C，32只；骨折后第5天手術組D，28只；骨折后第7天手術組E，24只；骨折后第11天手術組F，20只；骨折后第14天手術組G，16只。

1.3.3 各組不同處理 造模后A組在骨折后8h、第3、5、7、11、14、21、35、49天各時間點以斷頸法處死4只大鼠并觀察。

B組在骨折后即行骨折端切開復位內固定術。具體操作如下：用10%戊巴比妥鈉腹腔內按40mg/kg注射麻醉，起效后俯臥位，備右后肢皮膚。常規消毒鋪巾，行右股骨后外側切口，分離皮下組織和右后側肌間隙，顯露股骨中段骨折端，保護骨膜，骨折端復位。切開膝關節關節囊，暴露股骨內外側髁，于髁間倒置入直徑l.5mm的克氏針，固定骨折斷端。縫合切口，紗布包扎。術后3d青霉素注射防止感染。在術后8h、第3、5、7、11、14、21、35、49天各時間點以斷頸法處死4只大鼠并觀察。

C組在骨折后第3天行骨折端切開復位內固定術。具體操作同B組。在術后8h、第3、5、9、12、19、33、47天（即骨折后第3、5、7、11、14、21、35、49天）各時間點以斷頸法處死4只大鼠并觀察。

D組在骨折后第5天行骨折端切開復位內固定術。具體操作同B組。在術后8h、第3、7、10、17、31、45天（即骨折后第5、7、11、14、21、35、49天）各時間點以斷頸法處死4只大鼠并觀察。

E組在骨折后第7天行骨折端切開復位內固定術。具體操作同B組。在術后8h、第5、8、15、29、43天（即骨折后第7、11、14、21、35、49天）各時間點以斷頸法處死4只大鼠并觀察。

F組在骨折后第11天行骨折端切開復位內固定術。具體操作同B組。在術后8h、第4、11、25、39天（即骨折后第11、14、21、35、49天）各時間點以斷頸法處死4只大鼠并觀察。

G組在骨折后第14天行骨折端切開復位內固定術。具體操作同B組。在術后8h、第8、22、36天（即骨折后第14、21、35、49天）各時間點以斷頸法處死4只大鼠并觀察。

1.4 觀察指標

1.4.1 取材 各組大鼠處死后，以骨折端為中心，取下長度為1cm完整保留外骨膜以及骨痂的骨組織。

1.4.2 血管內皮細胞生長因子（VEGF）免疫組化染色觀察 立即將骨組織經10%的中性福爾馬林液固定,蒸餾水沖洗后，置入5%乙二胺四乙酸（EDTA）液中脫鈣10～15d。脫鈣成功后取材，沖水24h，脫水，石蠟包埋，5μm厚連續切片。切片進行VEGF免疫組化染色，二氨基聯苯胺（DAB）方法顯色，陽性為棕色。用計算機彩色圖像分析系統測定骨痂中VEGF含量。顯微鏡下放大400倍，每個標本隨機取5個視野，作陽性表達計數，以5個視野計數均值作為各標本VEGF表達的計量指標，結果進行統計學處理。

1.5 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件，計量資料采用表示，組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 各組大鼠VEGF表達的數值曲線 見圖1。

圖1 各組大鼠骨折端VEGF陽性染色細胞數量變化曲線圖

由圖1可見，A、B、C、D組VEGF表達的數值曲線在骨折后第14天達峰值，之后逐漸下降，E、F、G各組VEGF表達的數值曲線在骨折后第14、21天時進一步上揚，在第21天時達峰值，之后逐漸下降。在第35天時各組仍有一定的VEGF表達，E、F、G組較為明顯。2.2 各組大鼠骨折端VEGF陽性免疫組化染色細胞計數比較 見表1。

表1 各組大鼠骨折端免疫組化VEGF陽性染色細胞計數比較

由表1可見，在第14天時，D、E、F組VEGF表達＞A、B、G組＞C組，差異均有統計學意義（P＜0.05或0.01））；在第21天時，E、F、G組VEGF表達＞D＞A、B、C組，差異均有統計學意義（P＜0.05或0.01）；在第35天時，E組VEGF表達＞F、G＞A、B、C、D組，差異均有統計學意義（P＜0.05或0.01）；第49天時，隨著骨折漸趨愈合，各組僅有少量VEGF表達，組間比較差異無統計學意義。

3 討論

骨折修復是一個極其復雜的過程。血管形成，恢復骨折端供血是骨折修復的前提。VEGF是功能最強大的血管生成調節因子，通過與血管內皮細胞膜上的受體結合，特異性的促血管內皮細胞增生和血管生成[3]。血管生成對骨折段供氧、提供營養物質、運輸代謝廢物起到舉足輕重的作用，為局部骨再生及代謝提供了有利的微環境。Spector等[4]發現VEGF對體外培養的成骨細胞無增殖的作用，但能引發成骨細胞的遷移及分化，且引起成骨細胞遷移及分化所需的濃度比BMP-2還低100倍。另有研究表明在軟骨內化骨，特別是在骨形成偶合軟骨吸收的過程中，VEGF對原始成骨細胞有趨化遷移作用，對骨的形成和重建有功能性的作用[5]。Connoly[6]指出：骨折愈合完全依靠血管再形成過程，評價骨折愈合過程完全依靠血管再形成過程。因此，我們選用VEGF指標進行檢測，對于了解不同手術時間對骨折愈合過程的影響具有重要意義。

本實驗結果提示表明，E、F、G組的VEGF表達明顯強于A、B、C、D各組，且持續時間更長，其中E＞F＞G組，D組雖差于E、F、G組，但略優于A、B組，C組表現則最差。因此，各組骨折愈合過程中VEGF表達程度粗略排名顯示為：E＞F＞G＞D＞B=A＞C組。由此我們可以得出結論：手術操作干預了實驗大鼠骨折愈合不同階段VEGF的表達強度及表達時間。但并不是在任何時間點采取手術操作均是有益的，我們認為第7天手術組最能促進骨折端VEGF表達，且能持續更長時間。第11天手術組也能較好地促進骨折端VEGF表達，并能持續較長時間，第14天手術組次之。而第5天手術組僅在表達強度上高于自然愈合的未手術組，當天手術組與未手術組則無明顯差別，未表現出明顯促進骨折端VEGF表達的作用。而第3天手術組在骨折愈合的各階段均處于較低水平，且低于未手術組。

研究表明，骨折后1周內，骨折局部因創傷導致血流中斷，VEGF表達量較弱，隨著骨折的修復，肉芽組織的增長加快，血供相對減少，氧分壓降低，低氧狀態強烈誘導VEGF的表達。大約在骨折后2～3周，VEGFm-RNA表達量達到高峰，而此時恰為軟骨細胞合成期。VEGF在軟骨內成骨過程中協調著軟骨細胞向骨細胞的轉化[7-9]。我們推測在術后幾天內即對骨折端進行手術操作可能加重創傷，破壞骨膜的血管，導致血流中斷加劇，從而進一步減少VEGF的表達。在1～2周時段，骨折端肉芽生長明顯，骨膜增厚，盡管手術操作時適當地切開了骨膜，但對骨折端血流破壞較少，而且延長了炎癥期，促進了局部毛細血管的生成，使局部的血運得以進一步加強，從而有利于骨折的愈合，而這一切的發生與VEGF的分泌是緊密相關的。

綜上所述，我們認為骨折后采取手術操作能影響實驗大鼠骨折端VEGF的表達，可能導致二次損傷加速現象，但最佳手術時機在1～2周時段，骨折后幾天內即進行手術操作可能不利于骨折的愈合。

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Time interval of operation on VEGF expression in bone during fracture healing

Fracture healing Vascular endothelial growth factor Operative time

2012-10-23）

（本文編輯：田云鵬）

浙江省教育廳科研項目（20050869）

工作單位：310005 杭州，浙江中醫藥大學附屬第二醫院骨一科（董黎強、尹航、王昌興、胡偉鋒）；浙江中醫藥大學骨傷教研室（王維佳）

董黎強，E-mail：dlq58@126.com